More Text

Unordered List

Unordered List

BTricks

BThemes

Diberdayakan oleh Blogger.

Mengenai Saya

Foto saya

Just An Ordinary People
But I Have A Dream
And Someday, I Believe The Dream Will Be Come True :D

Kamis, 31 Oktober 2013

STUDI ABSORPSI OBAT SECARA IN VITRO - BIOFARMASI


STUDI ABSORPSI OBAT SECARA IN VITRO 




I.          Tujuan
Mempelajari pengaruh pH terhadap absorpsi obat melalui saluran pencernaan secara in vitro.

II.                Prinsip

1.      Absorpsi
Absorpsi atau penyerapan zat aktif adalah masuknya  molekul-molekul obat kedalam tubuh atau menuju keperedaran darah tubuh setelah melewati sawar biologik  (Aiache, et al., 1993). Absorpsi obat adalah peran yang terpenting untuk akhirnya menentukan efektivitas obat (Joenoes, 2002). Agar  suatu obat dapat mencapai tempat kerja di jaringan atau organ, obat tersebut harus melewati berbagai membran sel.

2.      Derajat Ionisasi
Derajat Ionisasi yaitu perbandingan jumlah mol zat yang terionisasi dengan jumlah mol zat mula-mula.Derajat ionisasi tergantung pada pH larutan dan pKa obat seperti terlihat pada persamaan  Henderson-Hasselbalch

3.      Persamaan  Henderson-Hasselbalch



4.      Kecepatan  transport  obat
Permeabilitas  membrane biologi terhadap suatu obat dapat digambarkan oleh koefisien partisinya dan mempunyai hubungan  linear  dengan kecepatan transport atau kecepatan absorpsinya, dinyatakan dengan persamaan :




III.             Teori Dasar

Proses absorpsi merupakan dasar penting dalam menentukan aktivitas farmakologis obat. Kegagalan atau kehilangan obat selama proses absorpsi akan mempengaruhi efek obat dan menyebabkan kegagalan pengobatan. Faktor mempengaruhi kecepatan dan besarnya absorbsi, termasuk bentuk dosis, jalur/rute masuk obat, aliran darah ketempat pemberian, fungsi saluran pencernaan (Gastrointestinal),  adanya makanan atau obat lain, dan variable lainnya (Abrams, 2005).
 Absorpsi atau penyerapan zat aktif adalah masuknya molekul-molekul obat ke dalam tubuh atau menuju ke peredaran darah tubuh setelah melewati sawar biologic. Absorpsi obat adalah peran yang terpenting untuk akhirnya menentukan efektivitas obat (Joenoes, 2002). Agar suatu obat dapat mencapai tempat kerja di jaringan atau organ, obat tersebut harus melewati berbagai membran sel. Pada umumnya, membrane sel mempunyai struktur lipoprotein yang bertindak sebagai membran lipid semipermeabel (Shargel and Yu, 1988). Sebelum obat diabsorpsi, terlebih dahulu obat itu larut dalam cairan biologis. Kelarutan serta cepat-lambatnya melarut menentukan banyaknya obat terabsorpsi. Dalam hal pemberian obat per oral, cairan biologis utama adalah cairan gastrointestinal, dari sini melalui membrane biologis obat masuk keperedaran sistemik (Joenoes, 2002).
Obat pada umumnya diabsorpsi dari saluran pencernaan secara difusi pasif melalui membrane selular. Obat-obat yang ditranspor secara difusi pasif hanyalah yang larut dalam lipid. Makin baik kelarutannya dalam lipid, maka baik absorpsinya sampai suatu absorpsi optimum tercapai. Obat-obat yang digunakan sebagian besar bersifat asam atau basa organik lemah. Absorpsi obat dipengaruhi derajat ionisasinya pada waktu zat tersebut berhadapan dengan membran. Membran sel lebih permeable terhadap bentuk obat yang tidak terionkan dari pada bentuk obat yang terionkan. Derajat ionisasi tergantung pada pH larutan dan pKa obat seperti terlihat pada persamaan Henderson-Hasselbach sebagai berikut :

(Watson, 2007).

Absorpsi obat adalah langkah utama untuk disposisi obat dalam tubuh dari sistem LADME (Liberasi-Absorpsi-Distribusi-Metabolisme-Ekskresi). Bila pembebasan obat dari bentuk sediaannya (liberasi) sangat lamban, maka disolusi dan juga absorpsinya lama, sehingga dapat mempengaruhi efektivitas obat secara keseluruhan (Joenoes, 2002).

a.       Ukuran partikel obat
Kecepatan disolusi obat berbanding langsung dengan luas permukaan yang kontak dengan cairan/pelarut. Bertambah kecil partikel, bertambah luas permukaan total, bertambah mudah larut
b.      Pengaruh daya larut obat
Pengaruh daya larut obat/bahan aktif tergantung pada:
     i.      Sifat kimia: modifikasi kimiawi obat
   ii.      Sifat fisik: modifikasi fisik obat
  iii.      Prosedur dan teknik pembuatan obat
 iv.      Formulasi bentuk sediaan/galenik dan penambahan eksipien 
c.       Beberapa faktor lain fisiko-kimia obat.
      i.     Temperatur
     ii.     pKa dan derajat ionisasi obat (Joenoes, 2002).

  Mekanisme Lintas Membran
            Mekanisme lintas membran berkaitan dengan peristiwa absorpsi, meliputi mekanisme pasif dan aktif (Syukri, 2002).
a.  Difusi pasif melalui pori
Semua senyawa yang berukuran cukup kecil dan larut dalam air dapat melewati kanal membran. Sebagian besar membran (membran seluler epitel usus halus dan lain-lain) berukuran kecil yaitu 4-7 Å dan hanya dapat dilalui oleh senyawa dengan bobot molekul yang kecil yaitu lebih kecil dari 150 untuk senyawa yang bulat, atau lebih kecil dari 400 jika senyawanya terdiri atas rantai panjang (Syukri, 2002). 

b.  Difusi pasif dengan cara melarut pada lemak penyusun membran
Difusi pasif menyangkut senyawa yang larut  dalam komponen penyusun membran. Penembusan terjadi karena adanya perbedaan konsentrasi atau elektrokimia tanpa memerlukan energi, sehingga mencapai keseimbangan pada kedua sisi membran. Waktu yang diperlukan untuk mencapai keseimbangan tersebut mengikuti hukum difusi Fick (Syukri, 2002).

c.   Tranpor aktif
Transpor aktif suatu molekul merupakan cara pelintasan transmembran  yang sangat berbeda dengan difusi pasif. Pada transpor aktif diperlukan adanya pembawa. Pembawa ini dengan molekul obat dapat membentuk kompleks pada permukaan membran. Kompleks tersebut melintasi membran dan selanjutnya molekul dibebaskan pada permukaan lainnya, lalu pembawa kembali menuju ke permukaan asalnya (Syukri, 2002).
Sistem transpor aktif bersifat jenuh. Sistem ini menunjukkan adanya suatu kekhususan untuk setiap molekul atau suatu kelompok molekul. Oleh sebab itu dapat terjadi persaingan beberapa molekul berafinitas tinggi yang menghambat kompetisi transpor dari molekul berafinitas lebih rendah. Transpor dari satu sisi membran ke sisi membran yang lain dapat terjadi dengan mekanisme perbedaan konsentrasi. Tranpor ini memerlukan energi yang diperoleh dari hidrolisis adenosin trifosfat (ATP) dibawah pengaruh suatu ATP-ase (Syukri, 2002). 

d.      Difusi terfasilitasi
Difusi ini merupakan cara perlintasan membran yang memerlukan suatu pembawa dengan karakteristik tertentu (kejenuhan, spesifik dan kompetitif). Pembawa tersebut bertanggung jawab terhadap transpor aktif, tetapi pada transpor ini perlintasan terjadi akibat gradien konsentrasi dan tanpa pembebasan energi (Syukri, 2002).

e.       Pinositosis
Pinositosis merupakan suatu proses perlintasan membran oleh molekul-molekul besar dan terutama oleh molekul yang tidak larut. Perlintasan terjadi dengan pembentukan vesikula (bintil) yang melewati membran (Syukri, 2002). 

f.  Transpor oleh pasangan ion
Transpor oleh pasangan ion adalah suatu cara perlintasan membran dari suatu senyawa yang sangat mudah terionkan pada pH fisiologik. Perlintasan terjadi dengan pembentukan kompleks yang netral (pasangan ion) dengan senyawa endogen seperti musin, dengan demikian memungkinkan terjadinya difusi pasif kompleks tersebut melalui membran (Syukri, 2002). 

Studi absorpsi in vitro dimaksudkan untuk memperoleh informasi tentang mekanisme absorpsi suatu bahan obat, tempat terjadinya absorpsi yang optimal, permeabilitas membrane saluran pencernaan terhadap berbagai obat, serta pengaruh berbagai faktor terhadap absorpsi suatu obat.

Biasanya menggunakan usus tikus kecil untuk parameter kinetic menentukan transportasi yang handal dan direproduksi. Metode ini mutlak diperlukan untuk mempertahankan oksigenasi jaringan kelangsungan jaringan usus yang hanya berlangsung selama maksimal 2 jam. Awalnya, studi ini hanya digunakan untuk mempelajari pengangkutan molekul makro dan liposom, namun kini telah mengembangkan penelitian untuk transportasi para seluler obat – obat yang hidrifil dan mempelajari efek dari enhancer dalam penyerapan obat.
Keuntungan dari metode ini adalah karena dapat digunakan untuk menentukan transportasi di berbagai segmen dari usus kecil, sebagai studi awal untuk transportasi obat, dan untuk memperkirakan tingkat level first pass metabolism obat pada sel epitelusus. Sementara kerugian adalah  karena adanya mukosa muskularis menyebabkan obat untuk berpindah dari lumen kedalam lamina propria dan menembus mukosa muskularis, menyebabkan obat – obat tertentu dapat terikat dengannya dan menyebabkan transportasi lebih rendah dari yang seharusnya diukur (Keperawatan, 2011).

Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang umum digunakan dalam penelitian ilmiah adalah tikus. Tikus (Rattusnor vegicus) telah diketahui sifat-sifatnya secara sempurna, mudah dipelihara, dan merupakan hewan yang relative sehat dan cocok untuk berbagai penelitian. Ciri-ciri morfologi Rattusnor vegicus antara lain memiliki berat 150-600 gram, hidung tumpul dan badan besar dengan panjang 18-25 cm, kepala dan badan lebih pendek dari ekornya, serta telinga relative kecil dan tidak
lebih dari 20-23 mm.
           



Usus halus terdiri dari duodenum, jejunum, dan ileum. Duodenum pada manusia memiliki panjang sekitar 25 cm terikat erat pada dinding dorsal abdomen dan sebagian besar terlatak retroperitoneal. Jalannya berbentuk sepertihuruf C yang mengitari pancreas dan ujung distalnya menyatu dengan jejunum yang terikat pada dinding dorsal rongga melalui mesenterium. Jejunum dapat bergerak bebas pada mesenteriumnya dan merupakan dua-perlima bagian proksimal usus halus. Sedangkan ileum merupakan sisa tiga-perlimanya. Dinding usus halus terdiri atas empat lapis konsentris yaitu mukosa, submukosa, muskularis, dan serosa (Leeson et al. 1990).
Lapisan mukosa terdiri dari lamina epitel, lamina propia, dan muskularis mukosa. Bentuk mukosa tersusun dari tonjolan berbentuk jari yang disebut vili yang digunakan untuk memperluas permukaan. Pada permukaan epitel vili terdapat mikrovili yang dapat meningkatkan efisiensi penyerapan nutrisi. Pada usus halus jugater dapat sel goblet yang menghasilkan mucus sebagai pelindung mukosa usus.
Membran mukosa adalah lingkungan yang unik dimana banyak spesies mikroorganisme yang berbeda dapat hidup dan berekspresi. Terdapat 1014 mikroorganisme dari 200 spesies, 40-50 genus hidup pada permukaan tersebut, dan 99% dari populasi mikroorganisme pada membrane mukosa terjadi di bagian distal usus halus dan di bagian proksimal kolon. Membran mukosa dalam suatut ubuh berkontak langsung dengan lingkungan luar dan membrane mukosa juga terkolonisasi oleh mikroorganisme yang berbeda dalam jumlah yang besar.

Asetosal (asam asetil salisilat) dikenal dengan nama dagang Aspirin, merupakan obat pereda nyeri golongan 'anti radang non steroid' (AINS), sering digunakan untuk mengatasi nyeri reumatik, pereda nyeri (analgesik), dan penurun demam (antipiretik).  Asetosal juga mempunyai efek mengurangi daya beku darah, sehingga dalam dosis rendah sering digunakan untuk penderita penyakit jantung koroner dan stroke (Familiamedika, 2013).



Pemerian             : hablur putih, umumnya seperti jarum atau lempengan tersusun, atau serbuk hablur putih; tidak berbau atau berbau lemah. Stabil di udara kering, di dalam udara lembab secara bertahap terhidrolisa menjadi asam salisilat dan asam asetat.
Kelarutan           : sukar larut dalam air, mudah larut dalam etanol, larut dalam kloroform dan eter.
(Depkes RI, 1995).
IV.              Alat dan Bahan


A.     ALAT


2.      Spektrofotometer




3.      Water-Bath

4.      TimbanganAnalitik



5.      pH Meter


6.      Alat-alat untuk operasi


7.      Alat-alatgelas

B.     Bahan
1.      Hewan percobaan (Tikus putih jantan)
2.      Cairan lambung buatan tanpa pepsin (pH 1,2), Cairan usus buatan tanpa pankreatin (pH 7,5)
3.      Larutan NaCl 0,9% b/v
4.      AsamSalisilat
5.      Eter
6.      Gas Oksigen
7.      Alkohol
8.      Seng Sulfat dan Barium Hidroksida


V.                 Prosedur
5.1       Pembuatan Kurva Baku
0,18 g asetosal standar ditambahkan etanol hingga 100 mL. Kemudian dibuat menjadi konsentrasi 120 ppm, 140 ppm, 160 ppm, 180 ppm, dan 200 ppm. Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam kuvet dan dimasukkan ke alat spektrofotometer uv-vis di panjang gelombang 297 nm. Lalu diukur masing-masing absorbansinya. Setelah itu dilakukan perhitungan dan dibuat kurva kalibrasinya.
5.2       Penentuan Absorpsi Pada Usus Halus Tikus
Hewan percobaan dipuasakan selama 20-24 jam, tetapi diberi minum air masak. Lalu tikus dibunuh dengan eter, kemudian dibuka perutnya di sepanjang linea mediana dan usus dikeluarkan. Setelah itu, usus sepanjang 15 cm di bawah pylorus dibuang dan 20 cm di bawahnya dipotong untuk percobaan. Lalu usus dibagi dua sama panjang dan dibersihkan. Bagian anal digunakan sebagai kontrol sedangkan ujung anal dari potongan usus tersebut diikat dengan benang. Kemudian dengan menggunakan pinset usus tersebut dibalik sehingga bagian mukosa terletak di luar.
Usus diisi dengan larutan NaCl 0,9% b/v sebanyak 1,4 ml. Lalu usus yang sudah diisi NaCl dan diikat, dimasukkan ke dalam tabung yang berisi cairan mukosal pH 1,2 sebanyak 75 ml (yang mengandung bahan obat) pada suhu 37oC. Perlakuan ini diulangi dengan tabung yang berisi cairan mukosal pH 7,4 (yang mengandung bahan obat) dan untuk kontrol menggunakan cairan mukosal pH 1,2 dan pH 7,4 juga tetapi tanpa bahan obat. Obat yang akan diuji dalam percobaan ini adalah asetosal. Selama percobaan berlangsung, seluruh bagian usus dijaga agar dapat terendam dalam cairan mukosal dan selalu dialiri gas oksigen dengan kecepatan kira-kira 100 gelembung per menit. Untuk larutan uji (berisi asetosal) tiap 5, 10, dan 15 menit, cairan serosal diambil melalui kanula yang dimasukkan ke dalam vial kemudian diisi lagi dengan 1,4 ml NaCl 0,9% b/v. Untuk kontrol (tanpa asetosal), setelah 5 menit cairan serosal diambil melalui kanula dan dimasukkan ke dalam vial. Melalui percobaan ini akan dihasilkan 8 vial berisi sampel yang akan dianalisis.
5.3       Analisis Asetosal dengan Spektrofotometer UV
Sebanyak 1 ml dari tiap vial diambil kemudian ditambahkan dengan 2 ml larutan seng sulfat 5% dan 2 ml barium hidroksida 0,3 N. Larutan dikocok dan disentrifugasi selama 5 menit. Lalu, bagian yang jernih diambil dan dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 297 nm. Setelah itu, dibuat grafik hubungan antara jumlah dan kadar obat yang ditranspor, dihitung permeabilitas dan lag timenya serta dihitung tetapan kecepatan absorpsi (Ka) nya.

VI.    Data pengamatan dan Hasil

I.                   Data Pengamatan
1.      Absorbansi Asetosal (Pelarut air, λ 274 nm)
[ ppm ]
1
2
3
Rata-rata A
200
0,5186
0,5188
0,5187
0,5187
180
0,5103
0,5104
0,5099
0,5102
160
0,4624
0,4628
0,4626
0,4626
140
0,3778
0,3777
0,3777
0,3773
120
0,3307
0,3305
0,3308
0,33067




Tabel 6.1. Absorbansi Asetosal
b = 0,03276
a = 2,5448 X 10-3
r = 0,970


2.      Kurva serapan asetosal


Gambar 6.1. Kurva Baku Asetosal

Waktu
Absorbansi
5
0,0633
10
0,1757
15
-0,0096
Tabel Hasil Absorbansi Sample pH 1.2
Waktu
Absorbansi
5
-1,164600
10
-1,2372
15
-1,0886





Tabel Hasil Absorbansi Sample pH 7.4


Waktu (Menit)
A/Y
C/X
Qb'
Fk
Qb
5
0,0633
12
16,8
16,8
33,6
10
0,1757
56,19
78,67
78,67
112,38
15
-0,0096
-16,65
-23,31
-23,31
-46,62
Tabel perhitungan absorpsi (pH 1.2)

Waktu (Menit)
A/Y
C/X
Qb'
Fk
Qb
5
-1,1646
-470,66
-658,924
-658,924
-1317,85
10
-1,2372
-499,2
-698,88
-698,88
-1397,76
15
1,0886
-415,03
581,04
581,04
1162,08




Tabel perhitungan absorpsi (pH 7.4)

Ket: A/Y = Hasil Pengukuran
        C/X = Konsentrasi
        Qb’ = Jumlah Obat yang diabsorpsi
        Fk = Faktor Koreksi
        Qb = Jumlah Obat yang diabsorpsi setelah dikoreksi









Tabel hasil perhitungan parameter absorpsi
Parameter Absorpsi
Percobaan
pH 1.2
pH 7.4
Ka
-8,022
247,993
Pm
-802,2
24799,3
Lag Time
14,12
12,09

Persamaan linier (pH 1.2): y = -8,022 X + 113,3
Persamaan linier (pH 7.4): y = 247,993 X – 2997,77

VII.           Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian absorpsi asetosal secara in vitro dengan menggunakan metode usus terbalik. Pengujian ini bertujuan untuk melihat pengaruh pH terhadap absorpsi obat melalui saluran pencernaan secara in vitro. Asetosal merupakan turunan salisilat yang sering digunakan sebagai senyawa analgesik (penahan rasa sakit atau nyeri minor), antipiretik (terhadap demam), dan anti inflamasi (peradangan) dan juga memiliki efek antikoagulan untuk mencegah serangan jantung dengan rumus struktur sebagai berikut :


Konsentrasi asetosal yang digunakan adalah sebesar 0,1M. Pembuatan asetosal 0,1 M dilakukan dengan menimbang sebanyak 0,18 gram asetosal kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan dilarutkan dengan menggunakan pelarut etanol karena menurut Farmakope Indonesia, asetosal agak sukar larut dalam air, dan mudah larut dalam etanol(95%) P. Pembuatan asetosal ini dilakukan secara kuantitatif karena akan digunakan untuk pembuatan kurva baku dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
Asam asetil salisilat dapat dianalisis secara kuantitatif dengan spektrofotometer UV-Visible karena berdasarkan strukturnya asam asetil salisilat memiliki gugus kromofor benzena cincin aromatik yang dapat mengabsorpsi radiasi elektromagnetik yang dihasilkan oleh spektrofotometer UV-Visible.
Untuk pembuatan kurva baku, dilakukan dengan membuat larutan asetosal dengan lima seri konsentrasi.  Pertama, dibuat larutan stok asam asetil salisilat 1000 ppm dalam pelarut etanol. Pelarut etanol digunakan agar kondisi pengukuran sampel dengan baku adalah sama. Dibuat larutan dengan konsentrasi bertingkat dengan melakukan pengenceran terhadap larutan stok asam asetil salisilat, yaitu 120, 140, 160, 180 dan 200 ppm. Masing-masing konsentrasi larutan tersebut diukur absorbansinya pada spektrofotometer UV-Vis. Pengukuran absorbansi dari asetosal dengan spektrofotometer UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum, kepekaannya juga maksimum karena pada panjang gelombang maksimum tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Di sekitar panjang gelombang maksimum juga, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert Beer terpenuhi. Selain itu, jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali ketika digunakan panjang gelombang maksimul (Gholib, 2007). Panjang gelombang maksimum yang didapat dari percobaan dan digunakan untuk pengukuran asetosal adalah 297 nm.
Setelah kelima seri konsentrasi tersebut diukur absorbansinya, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (sumbu y) dengan konsentrasi (sumbu x).
Pada konsentrasi 120 ppm, absorbansi sampel rata-rata adalah 0,33067 , pada konsentrasi 140 ppm, absorbansinya 0,3773 , pada konsentrasi 160 ppm, absorbansi sampel 0,4626 , pada konsentrasi 180 ppm, absorbansi 0,5102 dan pada konsentrasi 200 ppm, absorbansinya 0,5187. Dari data absorbansi dan konsentrasi asetosal, didapatkan persamaan kurva yaitu :
dimana y merupakan absorbansi dan x merupakan konsentrasi. Nilai r dari kurva yaitu 0,970. Persamaan yang didapatkan dari kurva baku ini digunakan selanjutnya dalam menghitung konsentrasi sampel.
Pada percobaan ini hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih jantan. Tikus putih biasa digunakan dalam percobaan laboratorium karena mudah dikembangbiakkan dan mudah dalam perawatannya, hewan ini juga memiliki struktur anatomi fisiologi yang hampir sama dengan manusia. Sehingga hasil uji yang dicobakan pada tikus putih yang menyangkut struktur fisiologi anatomi dapat diaplikasikan pada manusia.
Sebelumnya, tikus percobaan dipuasakan dari makanan selama 20-24 jam, tapi diberi minum air masak. Tujuan dari tikus dipuasakan agar tidak ada faktor makanan lain yang mengganggu saat dilakukan percobaan serta untuk mengosongkan lambung dan usus.
Lalu tikus dibunuh dengan eter. Eter biasa digunakan sebagai obat bius yang diberikan melalui pernapasan. Kemudian dibuka perutnya di sepanjang linea mediana (linea mediana adalah garis yang melintas tepat ditengah tubuh dengan arah lintasan atas bawah/vertikal) dan usus dikeluarkan. Usus sepanjang 15 cm dibawah pilorus (pilorus adalah daerah atau bagian lambung bawah yang berhubungan dengan bagian atas duodenum/usus duabelas jari) dibuang dan 20 cm dibawahnya dipotong untuk percobaan. Usus dibagi dua bagian sama panjang, kemudian dibersihkan. Ujung dari potongan usus tersebut diikat dengan benang, kemudian dengan menggunakan pinset kecil usus tersebut dibalik secara perlahan agar usus tidak sobek, sehingga bagian mukosa terletak diluar. Tujuan dari peletakan mukosa usus diluar karena ingin menyamakan pengondisian seperti dalam tubuh manusia, dimana mukosa usus adalah bagian yang lipofil, sehingga diharapkan nantinya akan dapat diukur seberapa besar kadar zat aktif obat yang bersifat lipofil yang dapat diabsorpsi oleh mukosa usus. Kanula dimasukkan ke ujung oral dari usus yang belum terikat. Usus diukur dengan panjang efektif 7 cm yang sebelumnya diisi dengan cairan serosal 1,4 ml yang terdiri dari larutan natrium klorida 0,9% b/v. Kantong usus yang sudah berisi cairan serosal ini dimasukkan ke dalam tabung yang sudah berisi cairan mukosal 75 ml (yang mengandung bahan obat yaitu asetosal) pada suhu 37°C. Kantong usus untuk kontrol dilakukan dengan cara yang sama, tetapi dengan menggunakan cairan mukosal tanpa obat.
Selama percobaan berlangsung, seluruh bagian usus dijaga agar dapat terendam dalam cairan mukosal dan selalu dialiri gas oksigen dengan kecepatan kira-kira 100 gelembung per menit.
Pada waktu tertentu kadar obat dalam cairan serosal ditentukan. Untuk penentuan ini seluruh cairan serosal diambil melalui kanula dan segera dicuci dengan larutan 0,9% b/v natrium klorida, kemudian diisi lagi dengan 1,4 ml larutan 0,9% b/v natrium klorida.
Usus tikus yang telah didapatkan direndam dalam larutan NaCl fisiologis 0,9%  yang bersifat isotonis agar tidak kering dan rusak. Kemudian usus dipotong 20 cm dari bagian ujung dekat pilori (lambung) untuk dibuang, dan diambil 7 cm dari sisa usus untuk dibersihkan lalu dibalik sehingga bagian dalam usus berada diluar dan bagian luar usus berada didalam dengan pinset. Usus harus dibalik karena percobaan ini bertujuan untuk mengetahui kadar absorpsi obat oleh filia bagian dalam usus pada perbedaan pH yang diatur sesuai pH lambung dan pH usus secara in vitro (menggunakan instrumen yang menyerupai bagian dalam tubuh).
Setelah itu, salah satu ujung usus disambungkan ke pipa B pada instrument modifikasi crane&Wilson dan diikat dengan benang agar tidak mudah lepas sehingga instrument tersebut menjadi seperti gambar dibawah ini :

                Kemudian, ujung usus yang lain diikat dengan benang dan dikaitkan ke ujung pipa C, lalu larutan NaCl fisiologis dimasukkan kedalam usus sebanyak 1,4 ml melalui pipa B agar usus tetap basah dan tidak rusak, digunakan larutan NaCl fisiologis yang isotonis karena menyerupai cairan tubuh tikus/ mamalia. Selanjutnya, kedalam tabung instrument dimasukkan larutan dapar pH 1,2  melalui pipa A sebanyak 75 ml menggunakan syringe, larutan dibuat pada pH 1,2 agar menyerupai kondisi dalam lambung tikus/ mamalia. Instument dipanaskan diatas water bath hingga mencapai suhu 37oC agar menyerupai suhu didalam tubuh tikus/ mamalia. Larutan asam salisilat 0,01 M kemudian dimasukkan sebanyak 10 ml melalui pipa A kedalam larutan dapar sehingga bercampur dan didiamkan dengan selalu diberikan oksigen melalui pipa C. Oksigen diberikan agar sel-sel usus tetap hidup. Setiap 5 menit, larutan NaCl fisiologis didalam usus diambil melalui pipa B menggunakan syringe dan dimasukkan kedalam vial yang telah diberi label, kemudian diganti dengan 1,4 ml larutan NaCl fisiologis yang baru. Hal ini dilakukan sampai 15 menit berlangsung. Larutan NaCl fisiologis diambil dari usus setiap rentang waktu 5 menit karena akan dihitung kadar asam salisilat yang terabsorpsi melalui filia usus dan masuk kedalam larutan untuk mengetahui absoprsi optimal dari asam salisilat pada perbedaan pengaturan pH yang disesuaikan kondisi dalam tubuh mamalia.
                   Percobaan ini juga dilakukan dengan tabung instrumen diisi larutan dapar pH 7,4 yang disesuaikan dengan kondisi didalam usus, dengan ditambahkan pula 10 ml larutan asam salisilat 0,01 M. Kemudian dilakukan percobaan control negatif dengan prosedur yang sama menggunakan larutan dapar pH 1,2 dan pH 7,4 tanpa ditambahkan obat. Setelah itu, semua vial yang telah berisi larutan NaCl fisiologis diberi perlakuan awal untuk dianalisis menngunakan spektrofotometer UV.
Setelah dilakukan pengambilan cuplikan dari setiap rentang waktu 5 menit(5, 10 dan 15 menit) pada masing-masing pH 1,2 dan 7,4 dari masing-masing tabung, maka masing-masing cuplikan tersebut dianalisis menggunakan spektrofotometri UV untuk menetapkan konsentrasi asetosal selama proses absorpsi di dalam usus hewan percobaan. Adapun panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 274 nm. Alasan memilih panjang gelombang maksimum adalah karena panjang  gelombang maksimum memiliki kepekaan maksimal karena terjadi perubahan absorbansi yang paling besar dan pada panjang gelombang maksimum, bentuk kurva absorbansi terhadap konsentrasi memenuhi hukum Lambert-Beer. Sebelum dianalisis, masing-masing cuplikan dilarutkan kedalam larutan barium hidroksida 0,3 N dan sengsulfat 5% ( 5 gram dalam 100 ml). Fungsi barium hidroksida dan sengsulfat adalah untuk mengekstraksi asetosal dan memisahkan asetosal dari senyawa-senyawa lain yang mungkin terikut, sehingga hanya asetosal yang akan dianalisis menggunakan spektrofotometri UV. Pertama-tama harus dibuat larutan barium hidroksida 0,3 N dan sengsulfat 5%. Barium hidroksida (Ba(OH)2.8H2O) ditimbang sebanyak 4,732 gram, diperoleh dari rumus berikut:

(BM= 315,47) (FI IV, 1995 hal 1137) dan dilarutkan kedalam air panas sebanyak 100 ml. Sedangkan sengsulfat (ZnSO4. H2O) ditimbang sebanyak 5 gram dan dilarutkan kedalam 100 ml air (BM= 179,46) (FI IV, 1995 hal 836). Barium hidroksida agak sukar larut dalam air dingin, sehingga butuh pemanasan untuk melarutkannya, namun pada saat percobaan, barium hidroksida masih belum larut sempurna sekalipun dilarutkan dalam air panas sambil dipanaskan, sedangkan sengsulfat sangat larut dalam air. Setelah itu, sebanyak 2 ml dari larutan barium hidroksida dan 2 ml sengsulfat dicampurkan kedalam masing-masing 1 ml cuplikan, kemudian campuran larutan tersebut disentrifugasi untuk memisahkan endapan dengan filtratnya. Dimana filtrat yang berupa cairan jernih tersebut yang mengandung asetosal.Pada saat sentrifugasi, campuran larutan tersebut dimasukkan kedalam tabung sentrifugasi lalu tabungnya ditempatkan kedalam alat sentrifugasi secara berseberangan dan dengan jumlah yang sama, setelah itu diatur kecepatan pemutarannya, yaitu 3000 RPM (Revolutions Per Minute) (angka 30 dilayar dikali faktor pengali 100) selama 10 menit.Hasil sentrifugasi berupa larutan jernih di bagian atas dan endapan di bagian bawah. Bagian atas yang berupa larutan jernih diambil menggunakan pipet dan dimasukkan kedalam kuvet. Sebelum sampel diukur, alat spektrofotometer terlebih dahulu di-reference kedalam panjang gelombang yang sesuai menggunakan blanko yaitu blanko dari pH 1,2 dan 7,4 pada waktu = 0 menit. Selanjutnya masing-masing sampel cuplikan diukur absorbansinya. Adapun jumlah cuplikan yang diukur ada 6 buah (3 buah cuplikan (pada pengambilan 5, 10 dan 15 menit) pada pH 1,2dan 3 buah cuplikan dari pH 7,4. Absorbansi yang diperoleh dicatat.
Berdasarkan data pengamatan, nilai absorbansi yang didapatkan tidak sesuai dengan hukum Lambert Beer, yaitu konsentrasi yang baik itu berada di rentang absorbansi 0,2-0,8 yang terdeteksi dengan spektro UV. Pada saat pengukuran, nilai absorbansi yang diperoleh yaitu kebanyakan bernilai minus yaitu pada pH 1,2: -0,0096 (15 menit), sedangkan pada pH 7,4: -1,164600 (5 menit), -1,2372 (10 menit) dan -1,0886 (15 menit), artinya larutan yang dianalisis tidak terbaca serapannya oleh alat spektrofotometer UV. Dan ada  2 nilai absorbansi yang bernilai positif yaitu pada pH 1,2 : 0,0633 (5 menit) dan 0,1757 (10 menit) namun nilai absorbansi ini tetap tidak memenuhi hukum Lambert Beer yaitu rentang absorbansi yang diizinkan adalah 0,2-0,8. Hal ini terjadi karena kemungkinan waktu yang tidak cukup bagi obat asetosal untuk terabsorpsi. Kemungkinan asetosal akan terabsorpsi pada rentang waktu setelah 15 menit. Hasil absorbansi dimasukkan kedalam perhitungan untuk mencari konsentrasinya. Nilai absorbansinya dimasukkan kedalam persamaan regresi linier dari kurva baku asetosal. Dari data pengamatan terlihat bahwa data yang didapatkan tersebut menyimpang dari yang seharusnya, misalnya seperti, hasil absorbansi yang dihasilkan sangat aneh, nilai absorbansinya menurun pada pertambahan waktu. Seharusnya semakin lama, maka absorbansinya semakin tinggi, karena seharusnya semakin banyak obat yang terabsorpsi. Namun data nilai absorbansi yang dihasilkan pada pH 1,2 lebih tinggi dibandingkan dengan pada pH 7,4  itu adalah benar dan sesuai dengan teori, yaitu bahwa suatu obat yang bersifat asam akan terabsorpsi optimum di pH asam (lambung) dan obat yang bersifat basa terabsorpsi optimum di pH basa(usus). Pada percobaan kali ini, senyawa obat yang digunakan adalah asetosal (asam asetil salisilat), dimana senyawa obat ini bersifat asam, sehingga obat ini akan terabsorpsi optimum di pH asam. Setelah dilakukan perhitungan konsentrasi berdasarkan persamaan regresi linier dari kurva baku asetosal, maka data-data absorbansi dan konsentrasi di plotkan kedalam grafik. Di mana sumbu-x nya adalah waktu dan sumbu –y nya adalah konsentrasi. Jadi grafik yang terbentuk adalah grafik konsentrasi terhadap waktu. Dari grafik terlihat bahwa, pada pH 1,2 konsentrasi paling tinggi adalah pada waktu ke-10 menit, sedangkan pada pH 7,4 konsentrasi paling tinggi pada waktu ke -15 menit.



VIII.        Kesimpulan
Jadi, perbedaan variasi pH 1,2 dan pH 7,4 pada absorpsi obat melalui saluran pencernaan secara in vitro dengan interval waktu yang berbeda-beda menunjukkan perbedaan konsentrasi yang berbeda-beda dengan konsentrasi tertinggi pada pH 1,2 terdapat pada interval waktu ke-10 menit sedangkan konsentrasi tertinggi pH 7,4 terdapat pada interval waktu ke-15.



Daftar Pustaka

Anne Collins Abrams, RN, MSN. 2005. Clinical Drug Therapy. US. Wolters Kluwer Health, Lippincott Williams Wilkins.
  Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia IV. Jakarta. Departemen Kesehatan.
Familiamedika. 2013. Asetosal/Aspirin. Tersedia di http://familiamedika.net/obat-keluarga/asetosal.html#.UlCL--iyBCY [diakses tanggal 06 Oktober 2013]
Joenoes, Z. N. 2002. Ars Prescribendi Jilid 3.Surabaya. Airlangga University Press.
Keperawatan, A.  2011. Absorpsi obat. Tersedia di http://www.artikelkeperawatan.info/ materi-kuliah-studi-absorbsi-obat-159.html [diakses tanggal 05 Oktober 2013]
Leeson, C.R., T.S. Lesson, dan A.A. Paparo. 1990. Buku Ajar Histologi. Jakarta. Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Shargel, L and yu, A. B. C. 1988. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan. Surabaya. Airlangga University Press.
Syukri, S. 2002. KIMIA DASAR 1. Bandung. Penerbit ITB.
Watson, D.G., 2007. Analisis Farmasi. EGC. Jakarta.