LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID | BIOTEKNOLOGI

   LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID

TUJUAN

Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dan memetakan plasmid

PGEM T Easy dengan digesti menggunakan beberapa enzim restriksi.

TINJAUAN PUSTAKA Plasmid

Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA  melalui  teknologi DNA  rekombinan. Plasmid banyak  sekali  digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai  titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e).  mempunyai  penanda  seleksi,  yakni  gen  ketahanan  terhadap  antibiotik  tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi  bakteri untuk memperbanyak diri  sehingga pada  saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan

membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh  EDTA  dan  SDS  dibersihkan dengan cara  sentrifugasi, sehingga yang  tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan   protein   dan   polisakarida   dari   larutan).   Etanol   berfungsi   untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

Spektrofotometer

Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang  gelombang  256  nm  (260  nm).  Kualitas  DNA  yang  berhubungan  dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara  1,8-2,0  mencerminkan DNA  yang  relatif  murni  dan  terbebas  dari  kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260  = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006)

Elektroforesis

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel  agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA,

sehingga  molekul  DNA  dapat  terlihat  ketika  dilihat  di  atas  sinar  ultra  violet.  DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka  semakin  lambat  DNA  bermigrasi.  Semakin  besar  arus  yang  diberikan,  maka semakin cepat DNA bermigrasi.

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan  elektrik.  Gel  elektroforesis  mengambil  keuntungan  bahwa,  sebagai  asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda).

Sebelum   dilakukan   elektroforesis,   suspensi   DNA   terlebih   dahulu   harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Restriksi

Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong

DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen.

Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme. Jika bakteri E. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus, maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. Namun, jika bakteri E. coli memiliki enzim restriksi, kemungkinan infeksi virus akan menurun.

Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, misalnya DNA-metil transferase (dnmt). Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh enzim restriksi tidak akan terpotong.

Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub  unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan  perlu tidaknya kofaktor. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola  pita-pita  yang  spesifik  pada  gel  agarosa.  Enzim  tipe  inilah  yang  dipakai  untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna.

Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan  reaksi.  Meskipun  demikian,  sebagian  besar  peneliti  mengikuti  pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi

variasi dalam sumber, jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna.

Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara  pemipetan  atau  menggoyang  tabung  reaksi.  Sentrifus  dengan  cepat  selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung.

Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA.

Pemetaan Plasmid

Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994), dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang   dihasilkan   oleh   tiap-tiap   endonuklease   restriksi   harus   ditentukan   dengan elektroforesis gel,  kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil  yang  didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi.

BAHAN DAN METODE KERJA

Isolasi DNA Plasmid

Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah E. coli yang telah tersisipi plasmid.

Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l, bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam. Kemudian 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam

100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 + EDTA) dan di-vortex. Kemudian ditambah

200 ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS). Suspensi dihomogenkan dengan membolak- balik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit. Bufer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8) ditambahkan  sebanyak  300  ul  dan  dihomogenkan  dengan  membolak-balik  tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam. Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5,2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air. Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10 menit pada 4°C. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM).

Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer

Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau

TE. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang

260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260  = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Untuk mengetahui kemurnian DNA  terhadap kontaminan protein, nilai  absorbansi 260  nm  dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.

Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x

(Tris-HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM, EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl

100 mM, asam borat 83 mM, EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave. Setelah  suhu  tidak  terlalu  panas  (60°C),  gel  dicetak  dengan  menggunakan gel  tray (cetakan gel)  dan  dipasang sisir  untuk  membuat sumuran, lalu  dibiarkan beku.  Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene cyanol FF

0,25%, sukrosa 40%). Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi, direndam dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.

Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid

Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen, 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Selesai inkubasi, dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA. Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi  ditambahkan lagi.  Bila  telah  terpotong,  aktivitas  enzim  dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C. Selanjutnya, dilakukan elektroforesis  kembali  untuk  menentukan  ukuran  plasmid  dan  fragmen-fragmennya. Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3. HindIII, 4. SacI, 5. EcoRI dan HindIII, 6. HindIII dan SacI, 7. NotI dan HindIII, 8. NotI dan EcoRI.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA Plasmid

Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada tiga tahap penting yang perlu dilakukan, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi

DNA, 3. Pengendapan DNA.

Gambar 1. Lisis dinding dan membran sel bakteri

Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa lautan suspensi.

 Gambar 2. Ekstraksi DNA

Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi, terdapat senyawa DNA plasmid, RNA, Protein,  Senyawa Organik  dan  Komponen Lipid.  Ekstraksi dilakukan dengan  adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform

yang berat jenisnya besar.

Gambar 3. Pemurnian DNA dengan etanol

Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O.

Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer

Dari   DNA   plasmid   yang   diisolasi   diperoleh   dilakukan   kuantifikasi   dengan menggunakan metode spektrofotometri, didapatkan hasil seperti pada Tabel 1.

Tabel 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm

Kel	Abs λ260	Abs λ280	Abs λ260/ Abs λ280	konsentrasi ng/ul
6	2.213	1.333	1.66	110.6

Dari data spektrofotometri dapat diketahui bahwa larutan DNA plasmid kemungkinan masih terdapat protein sebagai kontaminan dimana rasio antara absorbansi λ260/λ280  sebesar  1.66  adalah  lebih  kecil  dari  1.8  sehingga  DNA  plasmid  yang didapatkan belum murni.

Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Analisis menggunakan gel agarose dilakukan dengan melakukan elektroforesis DNA sampel bersama dengan DNA penanda kuantitas. Konsentrasi DNA penanda kuantitas yang digunakan adalah 10 ng/ul, 20 ng/ul, 40 ng/ul.   Elektroforesis dilakukan sampai  larutan  pewarna  menjauhi  sumuran.  Untuk  kuantifikasi,  jarak  migrasi  yang ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA.

Gambar 4. Hasil elusi isolasi DNA Plasmid

Dari hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. Kemungkinan pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari sumur, pita DNA plasmid yang berada di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler. Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier.

Dari hasil elektroforesisi pun dapat dikuantifikasi konsentrasi dari larutan DNA yang di dapatkan seperti pada kelompok 5, untuk 1 ul DNA plasmid yang dielektroforesis mengandung bobot 40 ng, sehingga apabila larutan DNA yang dimiliki adalah 50 ul maka konsentrasi DNA yang diisolasi adalah 2000 ng/50 ul atau 40 ng/ul. Sehingga ketika akan dilakukan restriksi maka larutan DNA yang dibutuhkan adalah sekitar 2.5 ul untuk mendapatkan 100 ng DNA.

Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid

Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa enzim restriksi menghasilkan pita-pita dengan ukuran basa yang berbeda dan unik sesuai dengan enzim restriksinya masing-masing. pada praktikum diperoleh pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid yang

telah direstriksi seperti yang terlihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi

Dari hasil elektroforesis untuk proses restriksi diperoleh panjang fragmen sebagai berikut,

1.  NotI: 3018 bp + 806 bp

2.  EcoRI: 3018 bp + 806 bp

3.  HindIII: 3824 bp

4.  SacI: 3711 bp + 113 bp

5.  EcoRI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp

6.  HindIII dan SacI: 3062 bp + 649 bp + 113 bp

7.  NotI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp

Dari hasil pemetaan dapat diketahui bahwa SacI, EcoRI dan NotI memiliki dua situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi pada tempat yang sama, sedangkan HindIII hanya memiliki satu situs pengenalan. Situs pengenalan pengenalan EcoRI dan NotI memiliki jarak restriksi yang sama.

SIMPULAN

1.  Dari isolasi DNA plasmid, diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh konsentrasi plasmid sebesar 110.6 ng/ul

2.  Dari hasil elektroforesis diperoleh beberapa tipe plasmid dari linear, sirkular, open sirkular dan diperoleh konsentrasi DNA 40 ng/ul.

3.  Dari hasil restriksi untuk pemetaan Plasmid diketahui pGem T Easy memiliki 4 situs restriksi dengan enzim SacI, EcoRI dan NotI dan HindIII.

DAFTAR PUSTAKA

Brock, T.  D., Michael T.  Madigan, john  M. Martinko and Paker. 1994. Biology of microorganisms. Prentice Hall.

Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Yayasan Essentia Medica.

Glick,  B.R.  and  J.J.  Pasternak.  1994.  Molekuler  Biotechnology,  Principles  and applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C.

Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.

Suharsono dan Widyastuti, U.  2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan

Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika

Read More

LAPORANPRAKTIKUM ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE | BIOTEKNOLOGI

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI :  ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE

TUJUAN

1.      Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.

2.      Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.

DASAR TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.  Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). 

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012).  Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994).

Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.  Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999). 

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.  Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002). 

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:

1.   Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2.     Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3.    Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar

(Davis dkk. 1994).

Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).

Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari: 

1.                  Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.

2.                  Tray : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.

3.                  Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.

4.                  Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis

(Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida  yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.  Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999).

Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).

ALAT DAN BAHAN

ALAT

1.   Satu set alat elektroforesis

2.   Mikropipet dan tip

3.   Gel Doc

4.   Power Supply

5.   Parafilm

BAHAN

1.   DNA Marker

2.   Produk DNA

3.   Ethidium Bromide (EtBr)

4.   dd H₂O

5.   Gel Agarose

6.   Loading Buffer (Loading dye)

7.   Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)

8.   Akuades

CARA KERJA

·         Pembuatan Gel Agarose

•       0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE.
•       Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan.
•       Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu ±50°C.
•       Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.
•       Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga mengeras.
•       Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk digunakan.

·         Elektroforesis

•    Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.
•       1µl loading dye dicampur dengan 3µl produk DNA pada parafilm yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet.
•       Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose.
•       Sedangkan untuk 3µl DNA marker 1kb dituangkan pada sumur/well yang berada pada paling tepi atas dan bawah.
•       Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply.
•       Power Supply ( 400mA, 90V) dinyalakan selama 30 menit.

·         Dokumentasi

•     Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama ± 15 menit.
•       Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama ± 15 menit.
•       Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil gambarnya.

HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL

PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan Protein), yaitu metode elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum ini.

Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).

Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).

Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:

1.Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.

2.Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau poliakrilamid

(Biosciences, 1999).

Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA.

Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).

Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%.  Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten praktikum.  Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras.  Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991). 

Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).

Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 4µl dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO₄) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.  Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.  Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.  Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII.  Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).

Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna.  Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994).

Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc.

Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk, 1994).

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1.        Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.        Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.  Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.        Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.        Densitas muatan

Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.  Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5.        Pori-pori gel

Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.        Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.        Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA

(Wolfe, 1993).

Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit kesalahan dalam penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu, dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu penyimpanan.

Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier.

KESIMPULAN

1.                  Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.

2.                  Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel agarose.

3.                  Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi linier.

4.                  Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.

DAFTAR PUSTAKA

Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences : USA.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego.

Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ.

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta.

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2^nd ed. Appleton & Lange, Norwola.

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing Company, New York.

Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8^th ed. John Wiley & Sons Inc., New York.

Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4^th ed. Merrill Publishing Co. : Columbus, Ohio.

Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).

Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.

Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York.

Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont.

Source : http://paj89.blogspot.com

Read More