LAPORAN PRAKTIKUM VALIDASI METODE PARAMETER LOD DAN LOQ | Analisis Farmasi

VALIDASI METODE PARAMETER LOD DAN LOQ PADA TABLETPARASETAMOL MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

 

I.                   Tujuan

 Praktikan dapat mengetahui dan melakukan validasi metode parameter batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) terhadap tablet parasetamol menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

II.                Prinsip

1.      Akurasi

2.      Presisisi

3.      Linieritas

4.      Spesifisitas

5.      LOD dan LOQ

III.             Teori Dasar

            Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya (Gandjar, 2007).

            Klasifikasi Metode Analisis

Menurut USP 30-NF25 (2007), metode analisis diklasifikasikan dalam 3 kategori, yaitu:

a.      Kategori I :

Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku obat dan sediaan obat jadi atau bahan aktif lainnya seperti pengawet

b.      Kategori II :

Metode analisis yang digunakan untuk penetapan cemaran dalam bahan baku obat atau hasil degradasinya dalam sediaan obat jadi

c.       Kategori III :

Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kinerja dan kualitas sediaan obat jadi, seperti uji disolusi dan uji pelepasan obat (Gandjar, 2007).

Parameter Validasi Metode Analisis

Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian, yaitu adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji kuantitatif komponen aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain itu, terdapat 8 parameter validasi metode analisis yaitu spesifisitas, presisi/ketelitian, akurasi/ketepatan, linearitas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. Pemilihan parameter yang akan diuji tergantung dari jenis dan metode pengujian yang akan divalidasi (Chan, 2004).

a.      Akurasi

Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur  (Gandjar, 2007).

 Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (Riyadi, 2009). Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam plasebo, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi (Riyadi, 2009).

Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya. Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dll. Recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 5% (Riyadi, 2009).

b.      Presisi

Precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presicion diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility (ketertiruan). Repeatability adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Repeatability dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal (Riyadi, 2009).

Reproducibility adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium (Riyadi, 2009).

c.       Linieritas dan Rentang

Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu. Sedangkan rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Rentang dapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (Ermer & Miller 2005).

Persamaan garis yang digunakan pada kurva kalibrasi diperoleh dari metode kuadrat terkecil, yaitu y = a + bx. Persamaan ini akan menghasilkan koefisien korelasi (r). Koefisien korelasi inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Penetapan linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi yang berbeda. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari 0.9970 (ICH, 1995).  Linearitas juga dapat diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer & Miller 2005).

d.      Selektivitas (Spesifisitas)

Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, hhanalisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas (Riyadi, 2009).

e.      Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi

            Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit kuantitasi merupakan parameter pengujian kuantitatif untuk konsentrasi analit yang rendah dalam matriks yang kompleks dan digunakan untuk menentukan adanya pengotor atau degradasi produk. Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh  (ICH, 1995).

Asetaminofen

Parasetamol atau asetaminofen adalah turunan para-aminophenol memiliki khasiat sebagai analgesik, antipiretik, dan aktivitas antiradang yang lemah. Parasetamol merupakan analgesik non-opioid sering dicoba pertama untuk pengobatan gejala berbagai tipe sakit kepala termasuk migrain dan sakit kepala tipe tensi.

Pemerian          : serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.

Berat jenis        : 1.263 g/cm³

Titik lebur        : 169°C (336°F)

Kelarutan         : dalam air 1,4 g/100 mL atau 14 mg/mL (20°C); larut

                           dalam air medidih, dan dalam NaOH 1 N; mudah larut

                           dalam etanol, methanol, tidak larut dalam kloroform,

               praktis tidak larut dalam eter, pentana dan benzene

Nama Kimia :  N-acetyl-p-aminophenol atau p-asetamedofenol atau

                           4’- hidroksiasetanilida

Rumus Empiris: C₈H₉NO₂

Berat Molekul :  151,16

Jarak lebur       :  antara 168-172  (Depkes RI, 1995).

            Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang 245 nm (A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang gelombang 257 nm (A11=715a) sedangkan pada inframerah memperlihatkan puncak pada 1506, 1657, 1565, 1263, 1227, 1612 cm−1. (Moffat dkk, 2005).

Spektrofotometri UV-Visible

            Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang di absorbsi oleh sampel. Spektrofotometer UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm. Sebagai sumber cahaya biasanya di gunakan lampu hydrogen atau deuterium untuk pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak (Dachriyanus, 2004).

IV.              Alat dan Bahan

Alat dan gambar alat

No	Alat	Gambar Alat
1	Beaker glass
2	Bulb pipet
3	Labu Ukur
4	Mortir dan stamper
5	Neraca Analitik
6	Spektrofotometer UV
7	Volume pipet

Bahan

1.      Etanol 95%

2.      Tablet parasetamol

V.                 Prosedur

Pembuatan kurva baku

            Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga tanda batas. Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat pengenceran hingga diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan 12 ppm. Masing-masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Preparasi sampel dan pembuatan larutan stock parasetamol

            Tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus menggunakan mortir dan stamper hingga halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang sebanyak 50 mg secara seksama, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtratnya diambil.

Pengenceran sampel parasetamol

1.      Larutan 100 ppm

Dipipet 2 ml larutan parasetamol 1000 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 100 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen.

2.      Uji LOD à,8415 ppm

Dipipet 0,17 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 0,8415 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen.

3.      Uji LOQ à 2,8052 ppm

Dipipet 0,56 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 2,8052 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen.

VI.              Data Pengamatan dan Perhitungan

DATA PENGAMATAN AKURASI TABLET PARACETAMOL

·        Pembuatan larutan tablet parasetamol

Ø  Massa tablet rata- rata = 545,24 mg

Ø  Dibuat konsentrasi larutan stok sampel

=  500 mg/ 50 ml

= 10000 ppm

Ø  Diencerkan = 400 ppm

Ø  Dibuat 3 variasi konsentrasi :

1.      12 ppm

V x 400 ppm = 20 x 12 ppm

V = 0.6 ml

2.      10 ppm

V x 400 ppm = 20 x 10 ppm

V = 0.5 ml

3.      8 ppm

V x 400 ppm = 20 x 8 ppm

V = 0.4 ml

·        Nilai absorbansi

Konsentrasi	Absorbansi
	I	II	III	Rata- rata
8 ppm	0.5256	0.5256	0.5254	0.5255
10 ppm	0.6888	0.6885	0.6888	0.6887
12 ppm	0.8231	0.8230	0.8241	0.8234

Persamaan garis larutan baku : y = 0.07012x – 0.091472

·        Perhitungan konsentrasi sampel

1.      8 ppm

0.5255 = 0.07012x – 0.091472

x = 8,800 ppm

2.      10 ppm

0.6887 = 0.07012x – 0.091472

x = 11,126 ppm

3.      12 ppm

0.8234 = 0.07012x – 0.091472

x = 13,047 ppm

·        Persen recovery

Persen recovery (%) =  x 100 % Keterangan : a = konsentrasi contoh + konsentrasi standar yang ditambahkan b = konsentrasi contoh c = konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan

1.      8 ppm

=  x 100 % = 110 %

2.      10 ppm

=  x 100 % = 111,26 %

3.      12 ppm

=  x 100 % = 108,725 %

Dari hasil yang diperoleh, nilai ini masih dapat diterima akurasinya karena menurut (AOAC, 1998), secara umum nilai akurasi yang dapat diterima sebesar 80- 120%.

DATA PENGAMATAN PRESISI TABLET PARACETAMOL

·        Penimbangan Tablet dan Sampel

Berat 20 tablet  = 12,6672 gram

Berat 1 tablet    = 0,63336 gram

Jumlah parasetamol dalam tablet 0,63336 gram adalah 0,5000 gram atau 500 mg

Berat Sampel obat yang ditimbang                    = 0,0632 gram

Berat parasetamol dalam sampel adalah            = 0,4989 gram

·        Perhitungan konsentrasi sampel

Kadar Sampel =  = 1995,6 ppm

·        Pengenceran Sampel

V1 x N1           = V2 X N2

V1 x 1995,6     = 25 ml x 6 ppm

V1                   = 0,075 ml ...........  Ad hingga 25 ml

·        Hasil Absorbansi

Pengulangan	Absorbansi	Kadar ( x )	( x -  )	( x -  )2
1	0,3315	108,5	7,49	56,1001
2	0,3072	100,56	-0,45	0,2025
3	0,3040	99,51	-1,5	2,25
4	0,3024	98,98	-2,03	4,1209
5	0,3028	99,12	-1,89	3,5721
6	0,3036	99,37	-1,64	2,6896

·        Perhitungan Standar Deviasi

SD =  =  = 3,713

·        Perhitungan RSD

RSD =  = 0,0367

·        Perhitungan CV

CV = 0,0367 X 100 % = 3,67 %

·        Perhitungan CV Harwitz

CV (%) = 0,66 X 2 ^{1 – ( 0,5 X 6 )} = 0,165 %

DATA PENGAMATAN LINEARITAS TABLET PARASETAMOL

Larutan baku paracetamol 100 ppm

Blanko H2O : NaOH (1:1)

Pengenceran (Volume 10 ml)

Volume standar (ml)	Konsentrasi (ppm)
0,4	4
0,6	6
0,8	8
1,0	10
1,2	12

Pengukuran Absorbansi

Konsentrasi (ppm)	A1	A2	A3	A4	A5	A6
4	0,2092	0,2097	0,2120	0,2106	0,2102	0,2097
6	0,3050	0,3048	0,3052	0,3061	0,3062	0,3055
8	0,4622	0,4618	0,4610	0,4621	0,4621	0,4620
10	0,6176	0,6176	0,6174	0,6170	0,6181	0,6147
12	0,7561	0,7549	0,7562	0,7550	0,7558	0,7545

Linearitas

Pengukuran	R	a	b
1	0,9971	0,07032	-0,09654
2	0,99703	0,07016	-0,091152
3	0,99677	0,07003	-0,08988
4	0,99712	0,069985	-0,08972
5	0,997132	0,070155	-0,09076
6	0,99714	0,070075	-0,09078
Rata-Rata	0,99704	0,07012	-0,091472

DATA PENGAMATAN SPESIFISITAS TABLET PARASETAMOL

a.       Berat tablet total (19 tablet)            = 13095,1 mg

b.      Berat satuan tablet (1/19 tablet)      = 677,6 mg

c.       Berat serbuk total   (19 tablet)        = 12900 mg

d.      Berat serbuk (1/19 tablet)               = 682 mg

e.       Konsentrasi filtrate tablet Parasetamol (larutan filtrate stock)

Konsentrasi = 5000 ppm

f.        Pengenceran filtran tablet parasetamol

-         400 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

5000 ppm x V₁ = 400 ppm x 25 mL

V₁ = 2 mL

-         40 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

400 ppm x V₁ = 40 ppm x 10 mL

V₁ = 1  mL

g.       Pembuatan larutan Saccharum Lactis

Konsentrasi = 5000 ppm

h.       Pembuatan larutan uji tablet parasetamol

No.	Larutan Filtrat	Larutan SL	Pelarut	Total
1.	2,5 mL	0	22,5 mL	25 mL
2.	2,5 mL	1 mL	21,5 mL	25 mL
3.	2,5 mL	2 mL	20,5 mL	25 mL
4.	2,5 mL	3 mL	19,5 mL	25 mL
5.	2,5 mL	4 mL	18,5 mL	25    L

i.         Perhitungan parasetamol teoritis

-         4 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

400 ppm x V₁ = 4 ppm x 25 mL

V₁ = 2,5 mL

j.        Perhitungan saccharum lactis teoritis

-         200 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

5000 ppm x V₁ = 200 ppm x 25 mL

V₁ = 1 mL

-         400 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

5000 ppm x V₁ = 400 ppm x 25 mL

V₁ = 2 mL

-         600 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

5000 ppm x V₁ = 600 ppm x 25 mL

V₁ = 3 mL

-         800 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

5000 ppm x V₁ = 800 ppm x 25 mL

V₁ = 4 mL

k.      Pembuatan Kurva Baku Parasetamol

Konsentrasi = 100 ppm

Pengenceran :

-         4 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

100 ppm x V₁ = 4 ppm x 10 mL

V₁ = 0,4 mL

-         6 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

100 ppm x V₁ = 6 ppm x 10 mL

V₁ = 0,6 mL

-         8 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

100 ppm x V₁ = 8 ppm x 10 mL

V₁ = 0,8 mL

-         10 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

100 ppm x V₁ = 10 ppm x 10 mL

V₁ = 1 mL

-         12 ppm

M₁ x V₁ = M₂  x V₂

100 ppm x V₁ = 12 ppm x 10 mL

V₁ = 1,2 mL

l.         Absorbansi Baku Parasetamol

Konsentrasi (ppm)	Absorbansi
	A1	A2	A3	A4	A5	A6
4	0,2092	0,2097	0,2120	0,2106	0,2102	0,2097
6	0,4622	0,4618	0,4610	0,4621	0,4621	0,4620
8	0,3050	0,3048	0,3052	0,3061	0,3062	0,3055
10	0,6176	0,6176	0,6174	0,6170	0,6181	0,6174
12	0,7561	0,7549	0,7562	0,7550	0,7558	0,7545

Persamaan Garis

-         y = 0,07032 x – 0,09254

r² = 0,9971

-         y = 0,07016 x – 0,091152

r² = 0,99703

-         y = 0,07003 x – 0,08988

r² = 0,99677

-         y = 0,069985 x – 0,08972

r² = 0,99712

-         y = 0,070155 x – 0,09076

r² = 0,997132

-         y = 0,070075 x – 0,09078

r² = 0,99714

rata-rata persamaan garisnya :

y = 0,070120833 x – 0,0908053

m.     Absorbansi Larutan Uji

No.	A1	A2	A3	Rata-rata A
1	0,3063	0,3060	0,3059	0,3060
2	0,3166	0,3167	0,3163	0,3165
3	0,3132	0,3133	0,3136	0,3134
4	0,3727	0,3726	0,3729	0,3727
5	0,3299	0,3294	0,3292	0,3295

n.       Perhitungan Konsentrasi Parasetamol nyata

y = 0,070120833 x – 0,0908053

x = 

1.     x =  = 5,66 ppm

2.     x =  = 5,81 ppm

3.     x =  = 5,76 ppm

4.     x =  = 6,61 ppm

5.     x =  = 5,99 ppm

o.      Perhitungan % Recovery

% recovery =  x 100 %

1.      % recovery =  x 100 % = 0,332 %

2.      % recovery =  x 100 % = 0,362 %

3.      % recovery =  x 100 % = 0,352 %

4.      % recovery =  x 100 % = 0,522 %

5.      % recovery =  x 100 % = 0,398 %

Rata-rata % Recovery = 0,3932 %

DATA PENGAMATAN LOD DAN LOQ TABLET PARASETAMOL

 Tabel Hasil Pengukuran Absorbansi

No	Konsentrasi	Absorbansi
1	4 ppm	0.21023
2	6 ppm	0.30547
3	8 ppm	0.46187
4	10 ppm	0.61752
5	12 ppm	0.75542
Rata-rata		0.4701

            Perhitungan pengenceran larutan baku

            Larutan Baku Stock  100 ppm

1.     

2.     

3.     

4.     

5.     

           

No	Konsentrasi (x)	Absorbansi (y)	yi	(y-yi)
1	4 ppm	0.21023	0.18961	0.000425
2	6 ppm	0.30547	0.32985	0.000594
3	8 ppm	0.46187	0.47009	0.0000674
4	10 ppm	0.61752	0.61033	0.0000517
5	12 ppm	0.75542	0.75057	0.0000235
Jumlah				0.00116

y_i  didapat dari persamaan regresi y = 0.07012 x – 0.09087

x₁  = 4 ppm       à y = 0.07012 x 4 – 0.09087  = 0.18961

x₂  = 6 ppm       à y = 0.07012 x 6 – 0.09087 = 0.32985

x₃  = 8 ppm       à y = 0.07012 x 8 – 0.09087 = 0.47009

x₄  = 10 ppm     à y = 0.07012 x 10 – 0.09087= 0.61033

x₅  = 12 ppm     à y = 0.07012 x 12 – 0.09087= 0.75057

            Tabel Hasil Pengukuran LOD dan LOQ

	Konsentrasi	Absorbansi			Rata-rata
LOD	0.8415 ppm	0.0722	0.0722	0.0721	0.07217
LOQ	2.8052 ppm	0.0724	0.0723	0.0721	0.07227

            Larutan stock sampel  1000 ppm

Pengenceran stock

M₁     x V₁ = M₂ x V₂

1000 x V₁ = 100 x 20

            V₁ = 2 mL

Pengenceran larutan uji LOD

M₁   x V₁ = M₂   x V₂

100 x V₁ = 0.8415 x 20

          V₁ = 0.1683 mL

Pengenceran larutan uji LOQ

M₁   x V₁ = M₂  x V₂

100 x V₁ = 2.8052 x 20

          V₁ = 0.56104 mL

VII.                   Pembahasan Validasi LOD dan LOQ

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu seyawa obat, serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva validasi, akurasi, presisi, LOD, LOQ) dan penetapan kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan adalah tablet paracetamol dan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu praktikum selama 2 kali pertemuan.

         Spektrofotometer ultraviolet visible merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk  mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektra UV-Vis dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan atau atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. 

      Spektrofotometer UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif.  Pada analisa kualitatif karakteristik resapan suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu panjang gelombang maksimum dan daya resapnya. Penentuan panjang gelombang maksimum dengan membuat spektrum dengan cara membuat larutan baku primer/induk.

Langkah awal yang dilakukan adalah tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus menggunakan mortir dan stamper hingga halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang sebanyak 50 mg secara seksama, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtratnya diambil. Setelah tahap preparasi sampel, dilakukan tahap pembuatan kurva baku. Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga tanda batas. Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat pengenceran hingga diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan 12 ppm. Masing-masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Pipet sejumlah volume larutan induk dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh konsentrasi 10 um/mL . setelah  itu ukur serapannya dengan spektrofotometer untuk menentukan panjang gelombang maksimum. Setelah dianalisis dengan spektrofotometer didapatkan panjang gelombang maksimum untuk paracetamol adalah 243 nm. Berdasarkan literature,  panjang gelombang paracetamol 245 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih sesuai dengan panjang gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak terlalu jauh berbeda. Setelah itu, membuat kurva kalibrasi berdasarkan data panjang gelombang maksimum yang diperoleh, dibuat lima seri konsentrasi larutan  dari larutan induk dengan menggunakan rumus Lambert Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi larutan sebelumnya, ditentukan nilai konsentrasi minimum dan maksimum dengan rumus  A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang didapat adalah 4 ppm dan nilai konsentrasi maksimumnya 12 ppm. Selanjutnya dibuat lima seri konsentrasi larutan yaitu 4,6,8,10,12, ppm. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan pada panjang gelombang maksimum baku. Sehingga didapatkan persamaan regresi linear yaitu y=0,0702x - 0,09087. sehingga diperoleh nilai resapan 0,997 . 

Selanjutnya dihitung parameter validasi. Parameter validasi berguna untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi parameter adalah untuk menjamin metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal serta dapat dipercaya. Parameter yang diuji dalam validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit deteksi, limit kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas, dan uji kesesuaian sistem.

Setelah itu dicari batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ). Batas deteksi adalah titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari ketidakpastian yang terkait dengannya. Ini adalah konsentrasi terendah dari analit dalam suatu sampel yang dapat dideteksi namun tidak selalu diukur. Batas deteksi sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari metode analisis adalah kemampuan metode ini untuk membedakan perbedaan-perbedaan kecil konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah praktis, sensitivitas kemiringan kurva kalibrasi yang diperoleh dengan merencanakan respons terhadap konsentrasi analit atau massa.

Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah injeksi yang menghasilkan puncak dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali lebih tinggi tingkat kebisingan baseline. Selain itu sinyal / kebisingan metode, yang ICH menjelaskan tiga metode lebih lanjut:

1.                  Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh analisis sampel dengan konsentrasi analit dan dikenal dengan penentuan tingkat minimum yang analit dapat dipercaya terdeteksi.

2.                  Standar deviasi respon berdasarkan deviasi standar dari kosong: Pengukuran besarnya respons latar belakang analitis dilakukan dengan menganalisis jumlah sampel yang tepat kosong dan menghitung standar deviasi tanggapan ini.

3.                  Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan kurva kalibrasi: Sebuah kurva kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan sampel yang mengandung analit dalam kisaran batas deteksi. Deviasi standar residu dari garis regresi, atau standar deviasi dari y-perpotongan garis-garis regresi, dapat digunakan sebagai standar deviasi.

Gambar 1. Batas deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan

 Batas kuantifikasi (LOQ) adalah jumlah minimum yang disuntikkan menghasilkan pengukuran kuantitatif dalam matriks target dengan presisi diterima dalam kromatografi, biasanya membutuhkan ketinggian puncak 1-20 kali lebih tinggi dari dasar suara.

Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi telah ditentukan, EURACHEM (Gambar 2) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah sampel dengan penurunan jumlah analit adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari ketepatan diplot terhadap jumlah analit. Jumlah yang sesuai dengan yang dibutuhkan presisi didefinisikan sebelumnya adalah sama dengan batas kuantisasi.Adalah penting untuk tidak hanya menggunakan standar murni untuk tes ini tetapi juga matriks runcing yang erat merupakan sampel yang tidak diketahui.

Untuk batas deteksi, para ICH merekomendasikan, di samping prosedur seperti yang dijelaskan di atas, inspeksi visual dan deviasi standar respon dan kemiringan kurva kalibrasi.

Gambar 2. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode.

Berdasarkan hasil perhitungan tersebut, didapat yaitu nilai LOD 0.8415 dan nilai LOQ yaitu 2.8052. LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.

VIII.                Kesimpulan

LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan. Nilai LOD yaitu 0.8415 dan nilai LOQ yaitu 2.8052.

DAFTAR PUSTAKA

Association of Official Analytical Chemists. 1998. AOAC Perr- Verified Methods Program. Arlington : AOAC International.

Chan, C. C,. Lam, Herman. Lee, Y. C. and Zhang, Xue-Ming. 2004. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. John Wiley & Sons. Canada.

Dachriyanus. 2004.  Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi Edisi I. Penerbit Andalas University Press.  Padang.

Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI. Jakarta.

Ermer, J.H. and Miller, McB. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best Practice. Wiley-Vch. Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim.

Gandjar, G.I & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Belajar. Yogyakarta.

 [ICH] International Conference on Harmonization. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1). Tersedia di http://www.ich.org. [diakses tanggal 06 Juni 2013].

Moffat, A.C., dkk. 2005. Clarke‘s Analysis Of Drug And Poisons. Thirth edition. Pharmaceutical Press. Electronic version. London.

Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia di http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/validasi-metode-analisis/ [diakses tanggal 06 Juni 2013].

Read More

LAPORANPRAKTIKUM ISOLASI DNA PLASMID | BIOLOGI SELULER MOLEKULER

LAPORANPRAKTIKUM  ISOLASI DNA PLASMID BIOLOGI SELULER MOLEKULER 

A.    TUJUAN

Agar mahasiswa mampu mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli

B.     DASAR TEORI

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid.  Plasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat ditransfer ke bakteri lain dan memiliki ORI (Origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ORI hingga semua plasmid tereplikasi. Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting untuk pertumbuhan bakteri. Di alam, gen informasi ini sering mengkode protein yang akan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik. Plasmid mungkin merupakan hasil dari perkembangan heterotrop yang tertutup. Bakteri sering tumbuh pada lingkungan yang sama dengan mold dan fungi dan berkompetisi dengan mereka untuk mendapatkan makanan (bahan organik kompleks). Sebagai hasilnya, mold dan fungi menghasilkan toksin untuk membunuh bakteri (dalam dunia kedokteran sering deisebut dengan antibiotik) agar supaya menang dalam memperebutkan makanannya. Untuk menanggapi ini bakteri menghasilkan plasmid untuk mempertahankan hidupnya (Jakubowski. 2008). Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara alamiah pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik maupun parasitik pada sel inang.

Berdasarkan fungsinya plasmid dapat dikelompokkan menjadi:

1.    Fertility- F plasmids.

Merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain untuk  proses konjugasi. Plasmid ini juaga mempunyai kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik yang terdapat dalam plasmid ataupun dalam kromosom. Plasmid ditemukan antara lain pada Eschericia coli, Pseudomonas, dan Streptomyces.

2.    Resistance- R plasmids.

Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun dan inhibitor pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus.

3.    Plasmid penyandi bacteriocins.

Bacteriocins adalah senyawa yang diproduksi oleh bakteri untuk menghambat pertumbuhan atau bakteri lain yang spesises atau galurnya berbeda. Plasmid ini mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode protein yang berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins. Penamaan plasmid ini tergantung pada organisme yang memproduksinya. Misalnya plasmid Col pada bakteri Escherichia coli yang mengkode colicins.

4.    Degradative plasmids.

Merupakan plasmid yang mampu mencerna substansi yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat.

5.    Virulence plasmids.

Merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut patogen

Sedangkan berdasarkan jumlah plasmid di dalam sel dapat dibedakan menjadi:

1.    Low copy number plasmid dimana dalam satu sel hanya mengandung satu atau beberapa plasmid saja.

2.   High copy number dimana dalam satu sel mengandung banayak plasmid hingga ribuan. Contohnya bakteri E.coli.

Selain fungsi, plasmid juga memiliki bentuk yang beragam, antara lain:

1.      Supercoiled (covalently closed-circular).

DNA plasmid berbentuk sirkular dengan bentuk rantai yang terpilin.

2.      Relaxed circular.

Kedua ujung DNA menyatu dan berbentuk sirkuler.

3.      Supercoiled denature.

Kedua ujung DNA menyatu tapi pasangan basanya tidak sempurna.

4.      Nicked open circular.

Rantai DNA yang terpotong pada salah satu sisi saja.

Berbagai macam bentuk plasmid itu akan mempengaruhi kecepatan migrasi plasmid dalam elektroforesis. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, dan nicked open circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number  yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. Karena plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan keuntungannya, maka ada banyak cara yang digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion.

C.     ALAT DAN BAHAN.

1.      Alat :

·         Micropipet dan tip.

·         Tabung eppendorf 15 ml dan 1,5 µl.

·         Microsentrifuge.

·         Vortex.

·         Oven.

2.      Bahan :

·         Bakteri Escherchia coli.

·         Media pertumbuhan bakteri cair (LB/NA).

·         Larutan suspensi sel (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA).

·         Larutan lisis (0,2 M NaOH, 1% SDS).

·         Larutan netralisasi (1,32 M Kalium asetat pH 4,8).

·         FKI(Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol = 25 : 24 :1).

·         Sodium asetat 3M.

·         Ethanol absolut.

·         Ethanol 70%.

·         Aquades steril.

D.    LANGKAH KERJA.

Tahap isolasi.

1.        Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 37⁰ C dan dalam waktu 1 malam.

2.        Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet.

3.        Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml.

4.        Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan.

5.       Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.

6.       Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.

7.      Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali.

8.    Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet. 

9.   Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama 1 malam.

Tahap presipitasi.

1.    Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol  larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam.

2.       Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -2⁰C  sampai -4⁰C selama 1 jam.

3.       Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.

4.     Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit

Tahap pembilasan.

1.     Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.

2.       Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama  ± 5 menit.

3.       Menambahkan 50 mikrolit dH₂O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur.

4.         Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

E.     HASIL PERCOBAAN

1. Sentrifuge setelah inkubasi : Terbentuk dua lapisan yaitu supernatan yang berwarna keruh dan pellet yang berwarna kuning
2. Setelah Penambahab larutan C : Terbentuk endapan putih
3. Sentrifuge setelah penambahan larutan C : Terbentuk 3 lapisan. Lapisan bawah adalah pellet yang mengandung plasmid lapisan tengah adalah supernatant, dan lapisan atas adalah debris molekul

F.      PEMBAHASAN

Praktikum yang berjudul “Isolasi DNA Plasmid” ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli. Bakteri yang digunakan untuk diambil plasmidnya adalah bakteri Escherchia coli dikarenakan:

                                 1.         Mudah didapatkan.

                                 2.         Menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu yang singkat.

                                 3.         Memiliki jumlah plasmid yang banyak.

Beberapa teknik dapat digunakan untuk merusak sel Escherchia coli, untuk melepaskan molekul DNA plasmid. Metode yang digunakan pada isolasi DNA plasmid ini adalah metode alkali lisis atau lisis basa. Lisis basa adalah perusakan sel pada pH tinggi dengan NaOH dan SDS (sodium Duodenyl Sulfat), diikuti dengan pelepasan dan denaturasi DNA genomik (gDNA), material dinding sel, dan kebanyakan protein seluler. Meskipun DNA plasmid  super coil  juga terpengaruh karena rusaknya ikatan hidrogen akibat promosi basa, jika pH dijaga di bawah 12,5 pasangan basa terjaga dari pemisahan sempurna untai komplementer. Basa-basa berperan sebagai nuclei untuk renaturasi sempurna molekul DNA plasmid selama tahap netralisasi.

Jika lisis sel dilakukan pada pH di atas 12,5, atau jika pH ekstrim dalam larutan, pasangan basa plasmid dapat lepas dan terjadi denaturasi, membentuk pDNA single stranded. Setelah tahap lisis, larutan dinetralisasi dengan kalium asetat, yang mengendapkan SDS bersama-sama dengan gDNA terdenaturasi dan debris seluler. Pengerjaan berbeda dapat menghilangkan material tidak larut ini, sedangkan mayoritas pDNA tinggal dalam supernatan. Selama manipulasi, harus dijaga supaya tidak terjadi pemutusan gDNA membentuk fragmen-fragmen kecil yang tidak akan membentuk agregat.

 Langkah pertama yang dilakukan adalah mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair yang telah dipersiapkan dengan menggunakan mikropipet dan memasukkannya ke dalam tabung eppendorf 15 ml. Kemudian mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang biasa disebut dengan pellet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan.Dalam hal ini, sel bakteri Escherchia coli akan berada pada pellet sehingga kita mengambil pelletnya dan membuang bagian supernatan. Setelah itu menambahkan larutan A yang berisi Tris-HCl dan EDTA untuk mensuspensi pelet sampai larut dengan cara divortex. Di sini penmabahan larutan A akan membuat berat molekul sel menjadi lebih besar sehingga nantinya akan terendapsebagai pellet setelah disentrifuge. EDTA dapat berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain itu Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya.

Langkah selanjutnya adalah menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A lalu dibolak-balik 4-6 kali. Penambahan larutan B ini bertujuan untuk  melisiskan dinding sel bakteri di mana SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein serta NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai menghidrolisis RNA. Sehingga DNA kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini kemungkinan besar adalah DNA plasmid.

Berikutnya kami menambahkan larutan C yang berisi kalium asetat  sebanyak 2 ml. Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi serta pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Penambahan juga berfungsi untuk menetralkan pH sehingga DNA plasmid tidak rusak.  Setelah itu disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm. Setelah penambahan larutan netralisasi ini dihindari penggunaaan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal yang mungkin masih ada akan menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatan yang berisi DNA plasmid. Jadi, pada akhir tahap isolasi ini bagian yang diambil adalah supernatan yang mengandung DNA plasmid dan membuang pellet yang mengandung debris molekuler. Supernatan diambil sebanyak 4 ml kemudian didiamkan selam 1 malam.

Dari hasil percobaan, setelah ditambahkan larutan A, larutan B, dan larutan c ternyata hanya diperoleh sedikit pellet dan supernatant tampak keruh. Hal ini mungkin terjadi karena debris molekul tidak semuanya mengendap sebagai pellet namun masih tercampur dalam supernatan bersama plasmid sehingga supernatan tampak keruh. Tidak mengendapnya semua debris molekul mungkin disebabkan pada saat penambahan larutan A sebagai larutan suspensi,EDTA yang berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil belum bereaksi secara optimal. Selain itu Tris-HCl yang berfungsi menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya juga belum bereaksi optimal. Akibatnya, Tidak semua debris molekul dapat terendapkan sesuai ukuran dan berat molekulnya dan mencemari supernatan sehingga tampak keruh. Hal ini dapat juga disebabkan oleh kurang berfungsinya larutan B dalam melisiskan dinding sel bakteri sehingga tidak semua dinding dan sitoplasma dapat dirusak. Atau mungkin pula ketika mengambil kultur bakteri atau ketika  menambahkan larutan, baik  larutan A maupun larutan B, tip menyentuh dinding tabung sehingga plasmid terkontaminasi zat-zat pengotor. Dapat pula saat pengambilan kutur bakteri, ketika pengambilan pellet ternyata supernatan juga ikut terambil sehingga menyebabkan setelah penambahan larutan A, larutan B, dan larutan C, pellet sedikit dan supernatant menjadi keruh.

 Pada tahap presipitasi kami menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol  larutan ethanol 0,4 ml SodAc (Sodium Asetat) dan 10 ml larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam. Penambahan ethanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas. Ethanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Prinsip pengendapan dengan menggunakan ethanol absolut dingin yaitu : Saat penambahan garam yaitu Sod Asetat yang berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA, maka ion-ion seperti kation Na⁺ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion ⁺ (Na⁺) dan ^- (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Sehingga penambahan pelarut organik seperti ethanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na⁺ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. 

            Setelah penambahan ini, maka supernatan di dalam kedua larutan tersebut dimasukkan ke dalam freezer selama kurang lebih 1 jam. Tahap akhir dari presipitasi adalah sentrifuge supernatan beserta campurannya dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Hasil yang diperoleh adalah pelet yang mengandung DNA plasmid dan supernatan yang mengandung larutan NaOAc dan ethanol absolut. Sehingga, yang diambil pada tahap ini adalah bagian  pellet dan yang dibuang adalah bagian supernatan.

          Saat tahap presipitasi dilakukan ternyata didapatkan endapan/gumpalan putih yang merupakan protein menurutb keterangan dosen pembimbing. Hal ini juga mungkin berkaitan dengan langkah sebelumnya, atau mungkin saat pengambilan supernatan setelah penambahan larutan A, larutan B, dzan larutan C, pellet ikut terambil sehingga didapatkan plasmid yang sangat tidak murni.

     Tahap terakhir adalah tahap pembilasan DNA plasmid yang diperoleh dengan cara menambahkan 2 ml ethanol 70 % . Tujuannya yaitu untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni. Kemudian membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama  ± 5 menit. Setelah itu, menambahkan 50 mikrolit dH₂O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur. Langkah terakhir, memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

Plasmid hasil isolasi kali ini sangat buruk karena terdapat gumpalan putih yang merupakan protein sehingga kesulitan saat pemindahan dari tabung konikel ke tabung eppendorf menggunakan tip warna kuning yang sangat kecil. Sehingga, pada praktiknya, pemindahan plasmid oleh praktikan kemudian digunakan tip warna biru yang diameternya lebih besar. Namun, murni atau tidaknya plasmid hasil isolasi belum dapat diketahui sebelum dilakukan proses lebih lanjut, melalui proses running.

G.    KESIMPULAN

Dalam praktikum kali ini menggunakan metode alkali lisis untuk dapat mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia coli.

DAFTAR PUSTAKA

Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.

Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta :Erlangga.

Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. Molecular Cell Biology. Wh Freeman Company

Suryani, Yoni dkk. 2007. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.

Source : http://lulluakmalia.blogspot.com

Read More