VALIDASI METODE PARAMETER LOD DAN LOQ PADA TABLETPARASETAMOL MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
I. Tujuan
Praktikan dapat
mengetahui dan melakukan validasi metode parameter batas deteksi (LOD)
dan batas kuantifikasi (LOQ) terhadap tablet parasetamol menggunakan
spektrofotometri UV-Vis.
II. Prinsip
1. Akurasi
2. Presisisi
3. Linieritas
4. Spesifisitas
5. LOD dan LOQ
III. Teori Dasar
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium,
untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya. Validasi
metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode
analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya (Gandjar, 2007).
Klasifikasi Metode Analisis
Menurut
USP 30-NF25 (2007), metode analisis diklasifikasikan dalam 3 kategori,
yaitu:
a. Kategori I :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar
komponen utama dalam bahan baku obat dan sediaan obat jadi atau bahan aktif
lainnya seperti pengawet
b. Kategori II :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan cemaran dalam
bahan baku obat atau hasil degradasinya dalam sediaan obat jadi
c. Kategori III :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kinerja dan
kualitas sediaan obat jadi, seperti uji disolusi dan uji pelepasan obat (Gandjar, 2007).
Parameter
Validasi Metode Analisis
Prosedur analisis yang harus divalidasi
meliputi beberapa jenis pengujian, yaitu adanya pengotor, uji limit untuk
mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji kuantitatif komponen aktif
atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain itu, terdapat 8
parameter validasi metode analisis yaitu spesifisitas, presisi/ketelitian, akurasi/ketepatan, linearitas, kisaran, limit
deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. Pemilihan parameter yang akan diuji
tergantung dari jenis dan metode pengujian yang akan divalidasi (Chan, 2004).
Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan
hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam
keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang
tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut
seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan
pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas
sesuai prosedur (Gandjar, 2007).
Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode
simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard
addition method) (Riyadi, 2009). Kecermatan hasil analis
sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan
analisis. Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke
dalam plasebo, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan
dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat
ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis)
kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120%
dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang
akan divalidasi (Riyadi, 2009).
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis
lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan
ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan
dengan kadar yang sebenarnya. Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko
tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit
dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan
kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dll. Recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil
yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya persyaratan untuk
recovery adalah tidak boleh lebih dari 5% (Riyadi,
2009).
b. Presisi
Precision adalah ukuran yang
menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui
penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara
berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presicion diukur
sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Precision dapat
dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility
(ketertiruan). Repeatability adalah keseksamaan metode jika
dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam
interval waktu yang pendek. Repeatability dinilai melalui
pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang
terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi
yang normal (Riyadi, 2009).
Reproducibility adalah keseksamaan
metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan
dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi,
pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap
sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Kriteria
seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau
koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat
fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan
kondisi laboratorium (Riyadi, 2009).
c. Linieritas dan Rentang
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode
analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit
dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu. Sedangkan rentang metode adalah
pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat
ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Rentang dapat dilakukan dengan cara
membuat kurva kalibrasi dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui
konsentrasinya (Ermer & Miller 2005).
Persamaan garis yang digunakan pada kurva kalibrasi
diperoleh dari metode kuadrat terkecil, yaitu y = a + bx. Persamaan ini akan
menghasilkan koefisien korelasi (r). Koefisien korelasi inilah yang digunakan
untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Penetapan linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi
yang berbeda. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah lebih
besar dari 0.9970 (ICH, 1995). Linearitas
juga dapat diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer
& Miller 2005).
d. Selektivitas
(Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode
adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan
seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel.
Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree
of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang
ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya,
dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan
lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil
uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak
dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis
sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak
diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti
kromatografi, hhanalisis kelarutan fase, dan Differential Scanning
Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan
ukuran selektivitas (Riyadi, 2009).
e. Limit
Deteksi dan Limit Kuantitasi
Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel
yang dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya.
Limit kuantitasi adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat
ditentukan secara kuantitatif pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik.
Limit kuantitasi merupakan parameter pengujian kuantitatif untuk konsentrasi
analit yang rendah dalam matriks yang kompleks dan digunakan untuk menentukan
adanya pengotor atau degradasi produk. Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari rerata
kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh (ICH, 1995).
Parasetamol atau asetaminofen adalah
turunan para-aminophenol memiliki khasiat sebagai analgesik,
antipiretik, dan aktivitas antiradang yang lemah. Parasetamol merupakan
analgesik non-opioid sering dicoba pertama untuk pengobatan gejala berbagai
tipe sakit kepala termasuk migrain dan sakit kepala tipe tensi.
Pemerian :
serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.
Berat
jenis : 1.263 g/cm3
Titik
lebur : 169°C (336°F)
dalam air
medidih, dan dalam NaOH 1 N; mudah larut
dalam etanol,
methanol, tidak
larut dalam kloroform,
praktis tidak larut dalam eter, pentana dan benzene
Nama
Kimia : N-acetyl-p-aminophenol atau p-asetamedofenol atau
4’-
hidroksiasetanilida
Rumus
Empiris: C8H9NO2
Berat
Molekul : 151,16
Jarak
lebur : antara
168-172 (Depkes RI, 1995).
Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang
245 nm (A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang gelombang 257 nm
(A11=715a) sedangkan pada inframerah memperlihatkan puncak pada 1506, 1657,
1565, 1263, 1227, 1612 cm−1. (Moffat dkk, 2005).
Spektrofotometri UV-Visible
Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas
sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang di absorbsi oleh sampel.
Spektrofotometer UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau
kompleks dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400
nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm. Sebagai
sumber cahaya biasanya di gunakan lampu hydrogen atau deuterium untuk
pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak
(Dachriyanus, 2004).
IV. Alat dan Bahan
Alat dan gambar alat
|
No
|
Alat
|
Gambar Alat
|
|
1
|
Beaker glass
|
 |
|
2
|
Bulb pipet
|
 |
|
3
|
Labu Ukur
|
 |
|
4
|
Mortir dan stamper
|
|
|
5
|
Neraca Analitik
|
 |
|
6
|
Spektrofotometer UV
|
 |
|
7
|
Volume pipet
|
 |
Bahan
1. Etanol
95%
2. Tablet parasetamol
V. Prosedur
Pembuatan kurva baku
Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga
tanda batas. Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut
dibuat pengenceran hingga diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm,
6ppm, 8ppm, 10ppm, dan 12 ppm. Masing-masing konsetrasi diukur absorbansinya
menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang gelombang 245 nm kemudian dibuat
kurva baku.
Preparasi sampel dan pembuatan
larutan stock parasetamol
Tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus
menggunakan mortir dan stamper hingga halus. Kemudian serbuk parasetamol
ditimbang sebanyak 50 mg secara seksama, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50
ml. Ke dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok hingga larut lalu di-add
etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan tersebut
dikocok hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan
filtratnya diambil.
Pengenceran sampel parasetamol
1. Larutan 100 ppm
Dipipet 2 ml larutan parasetamol 1000 ppm dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas
dan diperoleh konsetrasi 100 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen.
2. Uji LOD à,8415 ppm
Dipipet 0,17 ml larutan parasetamol 100 ppm dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas
dan diperoleh konsetrasi 0,8415 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen.
3. Uji LOQ à 2,8052 ppm
Dipipet 0,56 ml larutan parasetamol 100 ppm dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas
dan diperoleh konsetrasi 2,8052 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen.
VI. Data Pengamatan dan Perhitungan
DATA PENGAMATAN AKURASI
TABLET PARACETAMOL
· Pembuatan larutan tablet parasetamol
Ø Massa tablet rata- rata = 545,24 mg
Ø Dibuat konsentrasi larutan stok sampel
= 500 mg/ 50 ml
= 10000 ppm
Ø Diencerkan = 400 ppm
Ø Dibuat 3 variasi konsentrasi :
1. 12 ppm
V x 400 ppm = 20 x 12 ppm
V = 0.6 ml
2. 10 ppm
V x 400 ppm = 20 x 10 ppm
V = 0.5 ml
3. 8 ppm
V x 400 ppm = 20 x 8 ppm
V = 0.4 ml
· Nilai absorbansi
|
Konsentrasi
|
Absorbansi
|
|||
|
I
|
II
|
III
|
Rata-
rata
|
|
|
8
ppm
|
0.5256
|
0.5256
|
0.5254
|
0.5255
|
|
10
ppm
|
0.6888
|
0.6885
|
0.6888
|
0.6887
|
|
12
ppm
|
0.8231
|
0.8230
|
0.8241
|
0.8234
|
Persamaan garis larutan
baku : y = 0.07012x – 0.091472
· Perhitungan konsentrasi sampel
1. 8 ppm
0.5255 = 0.07012x – 0.091472
x = 8,800 ppm
2. 10 ppm
0.6887 = 0.07012x – 0.091472
x = 11,126 ppm
3. 12 ppm
0.8234 = 0.07012x – 0.091472
x = 13,047 ppm
· Persen recovery
|
Persen
recovery (%) = x 100 %
Keterangan :
a = konsentrasi contoh +
konsentrasi standar yang ditambahkan
b = konsentrasi contoh
c = konsentrasi standar teoritis
yang ditambahkan
|
1. 8 ppm
= x 100 % = 110 %
2. 10 ppm
= x 100 % = 111,26 %
3. 12 ppm
= x 100 % = 108,725 %
Dari hasil yang diperoleh, nilai ini masih dapat diterima
akurasinya karena menurut (AOAC, 1998), secara umum nilai akurasi yang dapat
diterima sebesar 80- 120%.
DATA PENGAMATAN PRESISI
TABLET PARACETAMOL
· Penimbangan
Tablet dan Sampel
Berat
20 tablet = 12,6672 gram
Berat
1 tablet = 0,63336 gram
Jumlah
parasetamol dalam tablet 0,63336 gram adalah 0,5000 gram atau 500 mg
Berat
Sampel obat yang ditimbang
= 0,0632 gram
Berat
parasetamol dalam sampel
adalah =
0,4989 gram
· Perhitungan
konsentrasi sampel
Kadar
Sampel = = 1995,6 ppm
· Pengenceran
Sampel
V1
x N1 =
V2 X N2
V1
x 1995,6 = 25 ml x 6 ppm
V1 = 0,075
ml ........... Ad hingga 25 ml
· Hasil
Absorbansi
|
Pengulangan
|
Absorbansi
|
Kadar ( x )
|
( x - )
|
( x - )2
|
|
1
|
0,3315
|
108,5
|
7,49
|
56,1001
|
|
2
|
0,3072
|
100,56
|
-0,45
|
0,2025
|
|
3
|
0,3040
|
99,51
|
-1,5
|
2,25
|
|
4
|
0,3024
|
98,98
|
-2,03
|
4,1209
|
|
5
|
0,3028
|
99,12
|
-1,89
|
3,5721
|
|
6
|
0,3036
|
99,37
|
-1,64
|
2,6896
|
· Perhitungan
Standar Deviasi
SD = = = 3,713
· Perhitungan
RSD
RSD = = 0,0367
· Perhitungan
CV
CV = 0,0367 X 100 % = 3,67 %
· Perhitungan
CV Harwitz
CV (%) = 0,66 X 2 1 – ( 0,5 X 6 ) =
0,165 %
DATA PENGAMATAN LINEARITAS TABLET PARASETAMOL
Larutan baku paracetamol
100 ppm
Blanko H2O : NaOH (1:1)
Pengenceran (Volume 10 ml)
|
Volume
standar (ml)
|
Konsentrasi
(ppm)
|
|
0,4
|
4
|
|
0,6
|
6
|
|
0,8
|
8
|
|
1,0
|
10
|
|
1,2
|
12
|
Pengukuran Absorbansi
|
Konsentrasi
(ppm)
|
A1
|
A2
|
A3
|
A4
|
A5
|
A6
|
|
4
|
0,2092
|
0,2097
|
0,2120
|
0,2106
|
0,2102
|
0,2097
|
|
6
|
0,3050
|
0,3048
|
0,3052
|
0,3061
|
0,3062
|
0,3055
|
|
8
|
0,4622
|
0,4618
|
0,4610
|
0,4621
|
0,4621
|
0,4620
|
|
10
|
0,6176
|
0,6176
|
0,6174
|
0,6170
|
0,6181
|
0,6147
|
|
12
|
0,7561
|
0,7549
|
0,7562
|
0,7550
|
0,7558
|
0,7545
|
Linearitas
|
Pengukuran
|
R
|
a
|
b
|
|
1
|
0,9971
|
0,07032
|
-0,09654
|
|
2
|
0,99703
|
0,07016
|
-0,091152
|
|
3
|
0,99677
|
0,07003
|
-0,08988
|
|
4
|
0,99712
|
0,069985
|
-0,08972
|
|
5
|
0,997132
|
0,070155
|
-0,09076
|
|
6
|
0,99714
|
0,070075
|
-0,09078
|
|
Rata-Rata
|
0,99704
|
0,07012
|
-0,091472
|
DATA
PENGAMATAN SPESIFISITAS TABLET PARASETAMOL
a. Berat
tablet total (19
tablet) =
13095,1 mg
b. Berat
satuan tablet (1/19 tablet) = 677,6 mg
c. Berat
serbuk total (19 tablet)
= 12900 mg
d. Berat
serbuk (1/19
tablet)
= 682 mg
e. Konsentrasi
filtrate tablet Parasetamol (larutan filtrate stock)
Konsentrasi =
5000 ppm
f. Pengenceran
filtran tablet parasetamol
- 400
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
5000 ppm x V1 =
400 ppm x 25 mL
V1 = 2 mL
- 40
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
400 ppm x V1 =
40 ppm x 10 mL
V1 =
1 mL
g. Pembuatan
larutan Saccharum Lactis
Konsentrasi = 5000 ppm
h. Pembuatan
larutan uji tablet parasetamol
|
No.
|
Larutan Filtrat
|
Larutan SL
|
Pelarut
|
Total
|
|
1.
|
2,5 mL
|
0
|
22,5 mL
|
25 mL
|
|
2.
|
2,5 mL
|
1 mL
|
21,5 mL
|
25 mL
|
|
3.
|
2,5 mL
|
2 mL
|
20,5 mL
|
25 mL
|
|
4.
|
2,5 mL
|
3 mL
|
19,5 mL
|
25 mL
|
|
5.
|
2,5 mL
|
4 mL
|
18,5 mL
|
25 L
|
i. Perhitungan
parasetamol teoritis
- 4
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
400 ppm x V1 =
4 ppm x 25 mL
V1 = 2,5 mL
j. Perhitungan
saccharum lactis teoritis
- 200
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
5000 ppm x V1 =
200 ppm x 25 mL
V1 = 1 mL
- 400
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
5000 ppm x V1 =
400 ppm x 25 mL
V1 = 2 mL
- 600
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
5000 ppm x V1 =
600 ppm x 25 mL
V1 = 3 mL
- 800
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
5000 ppm x V1 =
800 ppm x 25 mL
V1 = 4 mL
k. Pembuatan
Kurva Baku Parasetamol
Konsentrasi = 100 ppm
Pengenceran :
- 4
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
100 ppm x V1 =
4 ppm x 10 mL
V1 = 0,4 mL
- 6
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
100 ppm x V1 =
6 ppm x 10 mL
V1 = 0,6 mL
- 8
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
100 ppm x V1 =
8 ppm x 10 mL
V1 = 0,8 mL
- 10
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
100 ppm x V1 =
10 ppm x 10 mL
V1 = 1 mL
- 12
ppm
M1 x V1 =
M2 x V2
100 ppm x V1 =
12 ppm x 10 mL
V1 = 1,2 mL
l. Absorbansi
Baku Parasetamol
|
Konsentrasi
(ppm)
|
Absorbansi
|
|||||
|
A1
|
A2
|
A3
|
A4
|
A5
|
A6
|
|
|
4
|
0,2092
|
0,2097
|
0,2120
|
0,2106
|
0,2102
|
0,2097
|
|
6
|
0,4622
|
0,4618
|
0,4610
|
0,4621
|
0,4621
|
0,4620
|
|
8
|
0,3050
|
0,3048
|
0,3052
|
0,3061
|
0,3062
|
0,3055
|
|
10
|
0,6176
|
0,6176
|
0,6174
|
0,6170
|
0,6181
|
0,6174
|
|
12
|
0,7561
|
0,7549
|
0,7562
|
0,7550
|
0,7558
|
0,7545
|
Persamaan
Garis
- y =
0,07032 x – 0,09254
r2 = 0,9971
- y =
0,07016 x – 0,091152
r2 =
0,99703
- y =
0,07003 x – 0,08988
r2 =
0,99677
- y =
0,069985 x – 0,08972
r2 =
0,99712
- y =
0,070155 x – 0,09076
r2 =
0,997132
- y =
0,070075 x – 0,09078
r2 =
0,99714
rata-rata persamaan
garisnya :
y = 0,070120833 x –
0,0908053
m. Absorbansi
Larutan Uji
|
No.
|
A1
|
A2
|
A3
|
Rata-rata A
|
|
1
|
0,3063
|
0,3060
|
0,3059
|
0,3060
|
|
2
|
0,3166
|
0,3167
|
0,3163
|
0,3165
|
|
3
|
0,3132
|
0,3133
|
0,3136
|
0,3134
|
|
4
|
0,3727
|
0,3726
|
0,3729
|
0,3727
|
|
5
|
0,3299
|
0,3294
|
0,3292
|
0,3295
|
n. Perhitungan
Konsentrasi Parasetamol nyata
y = 0,070120833 x –
0,0908053
x =
1. x = = 5,66 ppm
2. x = = 5,81 ppm
3. x = = 5,76 ppm
4. x = = 6,61 ppm
5. x = = 5,99 ppm
o. Perhitungan
% Recovery
% recovery = x 100 %
1. %
recovery = x 100 % = 0,332 %
2. %
recovery = x 100 % = 0,362 %
3. %
recovery = x 100 % = 0,352 %
4. %
recovery = x 100 % = 0,522 %
5. %
recovery = x 100 % = 0,398 %
Rata-rata % Recovery =
0,3932 %
DATA
PENGAMATAN LOD DAN LOQ TABLET
PARASETAMOL
Tabel Hasil
Pengukuran Absorbansi
|
No
|
Konsentrasi
|
Absorbansi
|
|
1
|
4 ppm
|
0.21023
|
|
2
|
6
ppm
|
0.30547
|
|
3
|
8 ppm
|
0.46187
|
|
4
|
10
ppm
|
0.61752
|
|
5
|
12 ppm
|
0.75542
|
|
Rata-rata
|
0.4701
|
|
Perhitungan
pengenceran larutan baku
Larutan Baku Stock 
100 ppm
100 ppm
1.
2.
3.
4.
5.
|
No
|
Konsentrasi (x)
|
Absorbansi (y)
|
yi
|
(y-yi)
|
|
1
|
4 ppm
|
0.21023
|
0.18961
|
0.000425
|
|
2
|
6
ppm
|
0.30547
|
0.32985
|
0.000594
|
|
3
|
8 ppm
|
0.46187
|
0.47009
|
0.0000674
|
|
4
|
10
ppm
|
0.61752
|
0.61033
|
0.0000517
|
|
5
|
12 ppm
|
0.75542
|
0.75057
|
0.0000235
|
|
Jumlah
|
|
|
0.00116
|
|
yi
didapat dari persamaan regresi y = 0.07012 x – 0.09087
x1 =
4 ppm à y = 0.07012 x 4 – 0.09087 = 0.18961
x2 =
6 ppm à y = 0.07012 x 6 – 0.09087 = 0.32985
x3 =
8 ppm à y = 0.07012 x 8 – 0.09087 = 0.47009
x4 =
10 ppm à y = 0.07012 x 10 – 0.09087= 0.61033
x5 =
12 ppm à y = 0.07012 x 12 – 0.09087= 0.75057
Tabel
Hasil Pengukuran LOD dan LOQ
|
|
Konsentrasi
|
Absorbansi
|
Rata-rata
|
||
|
LOD
|
0.8415 ppm
|
0.0722
|
0.0722
|
0.0721
|
0.07217
|
|
LOQ
|
2.8052
ppm
|
0.0724
|
0.0723
|
0.0721
|
0.07227
|
Larutan stock sampel 
1000 ppm
1000 ppm
Pengenceran
stock
M1 x V1 = M2 x V2
1000 x V1 =
100 x 20
V1 = 2 mL
Pengenceran
larutan uji LOD
M1 x V1 = M2 x V2
100 x V1 =
0.8415 x 20
V1 = 0.1683 mL
Pengenceran
larutan uji LOQ
M1 x V1 = M2 x V2
100 x V1 =
2.8052 x 20
V1 = 0.56104 mL
VII.
Pembahasan
Validasi LOD dan LOQ
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat
spektrofotometer ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan
optimum suatu seyawa obat, serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa
parameter validasi (kurva validasi, akurasi, presisi, LOD, LOQ) dan penetapan
kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan adalah tablet paracetamol dan
menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu praktikum selama 2 kali
pertemuan.
Spektrofotometer ultraviolet visible
merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan
sinar tampak. Alat ini digunakan untuk
mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi
dalam bentuk larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan
cahaya. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh
molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan
cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur
elektronik dari molekul. Spektra UV-Vis dari senyawa-senyawa organik berkaitan
erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik.
Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik,
molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan atau atom yang mengandung
elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat
energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut
sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat
digunakan untuk analisis kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat
menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan.
Spektrofotometer
UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada analisa kualitatif karakteristik resapan
suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu panjang gelombang maksimum dan daya
resapnya. Penentuan panjang gelombang maksimum dengan membuat spektrum dengan
cara membuat larutan baku primer/induk.
Langkah
awal yang dilakukan adalah tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus
menggunakan mortir dan stamper hingga halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang
sebanyak 50 mg secara seksama, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke
dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok hingga larut lalu di-add etanol
hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan tersebut dikocok
hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtratnya
diambil. Setelah tahap preparasi sampel, dilakukan tahap pembuatan kurva baku.
Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga
tanda batas. Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut
dibuat pengenceran hingga diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm,
6ppm, 8ppm, 10ppm, dan 12 ppm. Masing-masing konsetrasi diukur absorbansinya
menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang gelombang 245 nm kemudian dibuat
kurva baku.
Pipet sejumlah volume larutan induk
dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh konsentrasi 10 um/mL . setelah itu ukur serapannya dengan spektrofotometer
untuk menentukan panjang gelombang maksimum. Setelah dianalisis dengan spektrofotometer
didapatkan panjang gelombang maksimum untuk paracetamol adalah 243 nm.
Berdasarkan literature, panjang
gelombang paracetamol 245 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih
sesuai dengan panjang gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak
terlalu jauh berbeda. Setelah itu, membuat kurva kalibrasi berdasarkan data
panjang gelombang maksimum yang diperoleh, dibuat lima seri konsentrasi
larutan dari larutan induk dengan
menggunakan rumus Lambert Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi larutan
sebelumnya, ditentukan nilai konsentrasi minimum dan maksimum dengan rumus A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang
didapat adalah 4 ppm dan nilai konsentrasi maksimumnya 12 ppm. Selanjutnya
dibuat lima seri konsentrasi larutan yaitu 4,6,8,10,12, ppm. Setelah itu ukur
serapan masing-masing larutan pada panjang gelombang maksimum baku. Sehingga
didapatkan persamaan regresi linear yaitu y=0,0702x - 0,09087. sehingga
diperoleh nilai resapan 0,997 .
Selanjutnya dihitung parameter
validasi. Parameter validasi berguna untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi parameter
adalah untuk menjamin metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil
yang cermat dan handal serta dapat dipercaya. Parameter yang diuji dalam
validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit deteksi, limit
kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas, dan uji kesesuaian
sistem.
Setelah itu dicari batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ). Batas deteksi adalah
titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari ketidakpastian yang
terkait dengannya. Ini adalah konsentrasi terendah dari analit dalam suatu
sampel yang dapat dideteksi namun tidak selalu diukur. Batas deteksi
sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari
metode analisis adalah kemampuan metode ini untuk membedakan
perbedaan-perbedaan kecil konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah
praktis, sensitivitas kemiringan kurva kalibrasi yang diperoleh dengan
merencanakan respons terhadap konsentrasi analit atau massa.
Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah
injeksi yang menghasilkan puncak dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali
lebih tinggi tingkat kebisingan baseline. Selain itu sinyal / kebisingan
metode, yang ICH menjelaskan tiga metode lebih lanjut:
1.
Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh
analisis sampel dengan konsentrasi analit dan dikenal dengan penentuan tingkat
minimum yang analit dapat dipercaya terdeteksi.
2.
Standar deviasi respon berdasarkan deviasi
standar dari kosong: Pengukuran besarnya respons latar belakang analitis
dilakukan dengan menganalisis jumlah sampel yang tepat kosong dan menghitung
standar deviasi tanggapan ini.
3.
Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan
kurva kalibrasi: Sebuah kurva kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan
sampel yang mengandung analit dalam kisaran batas deteksi. Deviasi standar
residu dari garis regresi, atau standar deviasi dari y-perpotongan garis-garis
regresi, dapat digunakan sebagai standar deviasi.
Gambar 1. Batas
deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan
Batas kuantifikasi (LOQ) adalah jumlah minimum
yang disuntikkan menghasilkan pengukuran kuantitatif dalam matriks target
dengan presisi diterima dalam kromatografi, biasanya membutuhkan ketinggian
puncak 1-20 kali lebih tinggi dari dasar suara.
Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi
telah ditentukan, EURACHEM (Gambar 2) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah
sampel dengan penurunan jumlah analit adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari ketepatan diplot terhadap jumlah analit. Jumlah yang
sesuai dengan yang dibutuhkan presisi didefinisikan sebelumnya adalah sama
dengan batas kuantisasi.Adalah penting untuk tidak hanya menggunakan standar
murni untuk tes ini tetapi juga matriks runcing yang erat merupakan sampel yang
tidak diketahui.
Untuk batas deteksi, para ICH merekomendasikan,
di samping prosedur seperti yang dijelaskan di atas, inspeksi visual dan
deviasi standar respon dan kemiringan kurva kalibrasi.
Gambar 2. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode.
Berdasarkan hasil perhitungan
tersebut, didapat yaitu nilai LOD 0.8415 dan nilai LOQ yaitu 2.8052. LOD merupakan
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang
masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan
nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan.
VIII.
Kesimpulan
LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih
dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ
merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan.
Nilai LOD yaitu 0.8415 dan nilai LOQ yaitu 2.8052.
DAFTAR PUSTAKA
Association of Official Analytical Chemists. 1998. AOAC Perr- Verified Methods Program. Arlington : AOAC International.
Chan, C. C,. Lam, Herman. Lee, Y. C. and Zhang, Xue-Ming. 2004. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. John Wiley & Sons. Canada.
Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi Edisi I. Penerbit Andalas University Press. Padang.
Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI. Jakarta.
Ermer, J.H. and Miller, McB. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best Practice. Wiley-Vch. Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim.
Gandjar, G.I & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Belajar. Yogyakarta.
[ICH] International Conference on Harmonization. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1). Tersedia di http://www.ich.org. [diakses tanggal 06 Juni 2013].
Moffat, A.C., dkk. 2005. Clarke‘s Analysis Of Drug And Poisons. Thirth edition. Pharmaceutical Press. Electronic version. London.
Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia di http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/validasi-metode-analisis/ [diakses tanggal 06 Juni 2013].