TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi
DNA plasmid dan memetakan plasmid
PGEM T Easy dengan digesti
menggunakan beberapa enzim restriksi.
TINJAUAN PUSTAKA
Plasmid
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui
teknologi DNA rekombinan.
Plasmid banyak sekali
digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya.
Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam
sitoplasma dan dapat melakukan
replikasi secara autonom (Suharsono
dan Widyastuti, 2006).
Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid
dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid
mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;
b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang
secara otonomi; d). mempunyai
jumlah kopi yang banyak (multiple
copy) sehingga
terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat
DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda
seleksi,
yakni
gen
ketahanan
terhadap
antibiotik
tertentu
sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al.,
1994).
Secara garis besar isolasi
plasmid terdiri dari tiga tahapan
kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting,
tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu
memberikam kesempatan bagi
bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam
jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan
dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran
dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein,
fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan
sedangkan
membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium
dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat
magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel
maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan
untuk merusak membran sel. Ini
semua menyebabkan sel menjadi lisis.
Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang
tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan
phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform
(membersihkan protein
dan
polisakarida
dari
larutan). Etanol
berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).
Spektrofotometer
Jumlah DNA dicerminkan
berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi
harus dianalisis dengan
spektrofotometer UV dengan
panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas
DNA
yang
berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan
absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas
dari kontaminan
protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan
Widyastuti, 2006)
Elektroforesis
Dalam kegiatan
biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan
DNA, plasmid, dan produk
PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose
maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium
bromida (EtBr), kemudian
dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran
sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium
mengikat molekul
DNA,
sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar
ultra
violet.
DNA
merupakan molekul bermuatan
negatif, sehingga bila diletakkan dalam
medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin
rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya,
maka semakin lambat DNA bermigrasi.
Semakin
besar
arus
yang
diberikan, maka semakin
cepat DNA bermigrasi.
Gel elektroforesis
digunakan untuk memisahkan
fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan
molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara
gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan
kekuatan elektrik.
Gel
elektroforesis mengambil
keuntungan bahwa, sebagai asam
organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan
di dalam medan listrik,
molekul DNA menuju ke kutub positif
(anoda) dan menjauhi kutub
negatif (katoda).
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA
terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah
densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna
untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak
ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA
di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang
dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis
kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Restriksi
Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya
tersebut. Enzim ini telah ditemukan
lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan
dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap
bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri.
Bakteri pada mulanya
tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan
dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya.
Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII
dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong
DNA
pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan
kembali. Para peneliti dengan cepat segera
mengetahui bahwa enzim restriksi
merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan
untuk mempelajari organisasi,
fungsi, dan ekspresi gen.
Enzim restriksi
melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme. Jika bakteri E. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus, maka sebagian besar partikel
virus mampu menyebabkan infeksi. Namun, jika bakteri E. coli memiliki enzim restriksi, kemungkinan infeksi virus akan menurun.
Enzim restriksi
biasanya terdapat
dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi
lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan,
misalnya DNA-metil transferase (dnmt). Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali
oleh enzim restriksi tidak akan terpotong.
Secara umum, enzim restriksi
dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya kofaktor. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks,
multisubunit, kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi
yang memotong DNA pada area random yang jauh dari
sisi pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia
mungkin banyak berfungsi di dalam sel,
tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi
tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu
dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa.
Enzim
tipe
inilah
yang
dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning
gen. Enzim tipe III juga merupakan
kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini memotong
DNA di luar sekuen
yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai
DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna.
Ada beberapa
faktor kunci yang harus diperhatikan
untuk melakukan pemotongan
dengan enzim restriksi (enzyme digestion).
Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong
1 ug
DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam.
Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan
sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Meskipun
demikian,
sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi
variasi dalam sumber,
jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol,
EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan
penghambatan digesti dengan enzim tertentu.
DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong
sempurna.
Enzim restriksi
merupakan enzim yang tidak stabil.
Oleh karena itu, sebaiknya
disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian
besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C.
Enzim ini harus
tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer
dan harus selalu menjadi komponen
yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan
cara pemipetan
atau
menggoyang
tabung reaksi. Sentrifus dengan
cepat
selama
beberapa detik jika ada cairan
yang menempel di dinding
tabung.
Untuk menghentikan
reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA.
Pemetaan Plasmid
Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak
(1994), dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh
tiap-tiap endonuklease restriksi
harus
ditentukan dengan
elektroforesis gel, kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti
ganda, yaitu DNA dipotong dengan
dua enzim restriksi secara bersamaan.
Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan
memungkinkan pemetaan banyak tempat
restriksi.
BAHAN DAN METODE KERJA
Isolasi DNA Plasmid
Bakteri yang digunakan dalam
praktikum ini adalah E. coli yang telah tersisipi plasmid.
Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung
plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml
media LB (bacto tryptone 10g/l,
bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam.
Kemudian 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10
menit. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam
100
ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 + EDTA) dan di-vortex. Kemudian ditambah
200
ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS). Suspensi dihomogenkan
dengan membolak- balik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit. Bufer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8)
ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan
membolak-balik tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Supernatan
ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil
alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam. Kemudian
DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5,2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air. Setelah diinkubasi pada
30°C selama 2 jam,
dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70%
kemudian disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10 menit pada 4°C. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10 mM,
EDTA 1 mM).
Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer
Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau
TE. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya
pada panjang gelombang
260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Untuk mengetahui
kemurnian DNA terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi
260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.
Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x
(Tris-HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM, EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl
100 mM, asam borat 83 mM, EDTA 1 mM), dipanaskan
hingga jernih dengan microwave.
Setelah suhu tidak terlalu
panas (60°C),
gel dicetak dengan menggunakan
gel tray (cetakan gel)
dan
dipasang sisir
untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan
beku. Sisir dilepas kemudian gel dipindah
ke dalam electrophoresis chamber.
Sebanyak 1-2 ul DNA
dicampur dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol
biru 0,25%, xylene cyanol FF
0,25%, sukrosa 40%). Kemudian
sampel DNA tersebut serta penanda
kuantitas (marker, λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada
gel agarosa. DNA dimigrasikan
kemudian setelah selesai
migrasi, direndam dengan larutan
etidium bromide, dan dilihat di atas
UV setelah dicuci
dengan H2O.
Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.
Digesti dengan Enzim Restriksi
pada Pemetaan DNA Plasmid
Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen, 2 ul larutan penyangga
reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi
(10 unit/ul) dan dH2O hingga
volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf
500 ul (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi
selama 1 jam pada suhu 37°C. Selesai inkubasi,
dilakukan elektroforesis untuk mengecek
apakah enzim telah memotong
DNA. Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi
dan/enzim restriksi ditambahkan lagi.
Bila
telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan
dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C. Selanjutnya, dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya.
Enzim-enzim restriksi yang digunakan
antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3. HindIII, 4. SacI, 5.
EcoRI dan HindIII, 6. HindIII
dan SacI, 7. NotI dan HindIII,
8. NotI dan EcoRI.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA Plasmid
Dapat
diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri,
ada tiga tahap penting
yang perlu dilakukan, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi
DNA, 3. Pengendapan DNA.
Gambar 1. Lisis dinding dan membran sel bakteri
Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS
(sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran
sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi
single strain). Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan disentrifugasi
untuk diambil supernatannya berupa lautan
suspensi.
Gambar 2. Ekstraksi DNA
Pada larutan suspensi sebelum
diekstraksi, terdapat senyawa DNA plasmid, RNA,
Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan
adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol)
dengan tujuan untuk memisahkan
antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform
berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah
disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di
paling atas tempat DNA plasmid berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah
dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah
karena sifat chloroform
yang berat jenisnya
besar.
Gambar 3.
Pemurnian DNA dengan etanol
Fase air yang diambil kemudian diendapkan
menggunakan sodium acetat untuk
menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada
DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.
Pelet yang didapat kemudian
dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk
didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu
dilakukan resuspensi karena apabila
dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan
pemurnian dan proses vakum dengan
bantuan larutan
buffer TE ataupun
dH2O.
Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer
Dari
DNA
plasmid
yang
diisolasi diperoleh dilakukan kuantifikasi dengan
menggunakan metode spektrofotometri, didapatkan hasil
seperti pada Tabel 1.
Tabel 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang
260 dan 280 nm
|
Kel
|
Abs λ260
|
Abs λ280
|
Abs λ260/
Abs λ280
|
konsentrasi ng/ul
|
|
6
|
2.213
|
1.333
|
1.66
|
110.6
|
Dari data spektrofotometri dapat diketahui bahwa larutan DNA plasmid
kemungkinan masih terdapat protein sebagai kontaminan
dimana rasio antara absorbansi λ260/λ280
sebesar 1.66
adalah
lebih
kecil dari 1.8 sehingga DNA plasmid yang didapatkan belum murni.
Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Analisis menggunakan
gel agarose dilakukan dengan melakukan
elektroforesis DNA sampel bersama dengan DNA penanda
kuantitas. Konsentrasi DNA penanda kuantitas yang digunakan adalah 10 ng/ul, 20 ng/ul, 40 ng/ul.
Elektroforesis dilakukan sampai larutan pewarna
menjauhi
sumuran.
Untuk
kuantifikasi, jarak migrasi yang ditempuh tidak
perlu terlalu jauh dan untuk
menganalisis bentuk DNA.
Gambar 4. Hasil elusi
isolasi DNA Plasmid
Dari hasil elektroforesis
dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. Kemungkinan pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk
superheliks (ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari sumur, pita DNA plasmid yang berada di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling
dekat dengan sumur adalah pita DNA
plasmid yang berbentuk open sirkuler. Semakin
kompak suatu DNA maka akan bermigrasi
semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan
akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan
bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier.
Dari hasil elektroforesisi pun dapat dikuantifikasi konsentrasi dari larutan DNA yang di dapatkan
seperti pada kelompok 5, untuk 1 ul DNA plasmid yang dielektroforesis
mengandung bobot 40 ng, sehingga apabila larutan DNA yang dimiliki
adalah 50 ul maka konsentrasi DNA yang diisolasi adalah 2000 ng/50 ul atau 40 ng/ul. Sehingga ketika akan
dilakukan restriksi maka larutan DNA yang dibutuhkan
adalah sekitar 2.5 ul untuk
mendapatkan 100 ng DNA.
Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa
enzim restriksi menghasilkan pita-pita dengan ukuran basa yang berbeda
dan unik sesuai dengan enzim restriksinya
masing-masing. pada praktikum diperoleh
pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid yang
telah direstriksi seperti yang terlihat pada Gambar 5.
Gambar 5.
Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi
Dari hasil elektroforesis untuk proses restriksi diperoleh
panjang fragmen sebagai berikut,
1. NotI:
3018 bp + 806 bp
2. EcoRI:
3018 bp + 806 bp
3. HindIII: 3824 bp
4. SacI:
3711 bp + 113 bp
5. EcoRI
dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp
6. HindIII dan SacI: 3062 bp + 649 bp + 113 bp
7. NotI
dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp
SIMPULAN
1. Dari isolasi DNA
plasmid, diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh konsentrasi plasmid
sebesar 110.6 ng/ul
2. Dari hasil elektroforesis diperoleh
beberapa tipe plasmid dari linear, sirkular, open sirkular dan diperoleh konsentrasi DNA 40 ng/ul.
3. Dari hasil restriksi
untuk pemetaan Plasmid diketahui pGem T Easy memiliki 4 situs
restriksi dengan enzim SacI, EcoRI dan NotI dan HindIII.
DAFTAR PUSTAKA
Brock, T. D.,
Michael T. Madigan, john M. Martinko and Paker. 1994. Biology
of microorganisms. Prentice Hall.
Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Yayasan
Essentia Medica.
Glick, B.R.
and
J.J.
Pasternak. 1994. Molekuler
Biotechnology, Principles and applications of Recombinan DNA. ASM Press.
Washinton D.C.
Muladno, 2002. Teknik
Rekayasa Genetika. Pustaka
Wirausaha Muda. Bogor.
Suharsono
dan Widyastuti, U. 2006.
Penuntun Praktikum
Pelatihan Teknik Pengklonan
Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati
dan Bioteknologi, IPB Bahan Kuliah dan Praktikum
Rekayasa Genetika