LAPORANPRAKTIKUM ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE | BIOTEKNOLOGI

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI :  ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE

TUJUAN

1.      Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.

2.      Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.

DASAR TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.  Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). 

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012).  Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994).

Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.  Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999). 

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.  Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002). 

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:

1.   Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2.     Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3.    Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar

(Davis dkk. 1994).

Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).

Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari: 

1.                  Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.

2.                  Tray : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.

3.                  Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.

4.                  Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis

(Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida  yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.  Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999).

Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).

ALAT DAN BAHAN

ALAT

1.   Satu set alat elektroforesis

2.   Mikropipet dan tip

3.   Gel Doc

4.   Power Supply

5.   Parafilm

BAHAN

1.   DNA Marker

2.   Produk DNA

3.   Ethidium Bromide (EtBr)

4.   dd H₂O

5.   Gel Agarose

6.   Loading Buffer (Loading dye)

7.   Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)

8.   Akuades

CARA KERJA

·         Pembuatan Gel Agarose

•       0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE.
•       Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan.
•       Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu ±50°C.
•       Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.
•       Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga mengeras.
•       Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk digunakan.

·         Elektroforesis

•    Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.
•       1µl loading dye dicampur dengan 3µl produk DNA pada parafilm yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet.
•       Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose.
•       Sedangkan untuk 3µl DNA marker 1kb dituangkan pada sumur/well yang berada pada paling tepi atas dan bawah.
•       Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply.
•       Power Supply ( 400mA, 90V) dinyalakan selama 30 menit.

·         Dokumentasi

•     Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama ± 15 menit.
•       Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama ± 15 menit.
•       Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil gambarnya.

HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL

PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan Protein), yaitu metode elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum ini.

Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).

Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).

Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:

1.Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.

2.Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau poliakrilamid

(Biosciences, 1999).

Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA.

Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).

Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%.  Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten praktikum.  Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras.  Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991). 

Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).

Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 4µl dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO₄) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.  Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.  Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.  Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII.  Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).

Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna.  Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994).

Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc.

Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk, 1994).

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1.        Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.        Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.  Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.        Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.        Densitas muatan

Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.  Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5.        Pori-pori gel

Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.        Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.        Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA

(Wolfe, 1993).

Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit kesalahan dalam penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu, dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu penyimpanan.

Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier.

KESIMPULAN

1.                  Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.

2.                  Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel agarose.

3.                  Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi linier.

4.                  Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.

DAFTAR PUSTAKA

Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences : USA.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego.

Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ.

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta.

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2^nd ed. Appleton & Lange, Norwola.

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing Company, New York.

Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8^th ed. John Wiley & Sons Inc., New York.

Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4^th ed. Merrill Publishing Co. : Columbus, Ohio.

Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).

Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.

Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York.

Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont.

Source : http://paj89.blogspot.com