Laporan Praktikum PEMERIKSAAN FUNGSI GINJAL (Tes Urea Dengan Metode Enzimatis) | Biokimia Klinik

PEMERIKSAAN FUNGSI GINJAL

(Test Urea dengan Metode Kinetika Enzimatis)

I.              Tujuan

1.         Melakukan pemeriksaan fungsi ginjal dengan test urea secara kinetika enzimatis.

2.         Menginterpretasikan hasil pemeriksaan yang diperoleh.

II.           Prinsip

Reaksi enzimatis

                         urease                   

Urea + 2H₂O  -------------->2NH₄⁺  +  2HCO₃⁺

                                                                              GLDH

2-Oxoglutarate + NH₄⁺  + NADH  ------------>  L-Glutamate + NAD⁺  +  H₂O

III.        Teori Dasar

Ureum adalah suatu molekul kecil yang mudah mendifusi ke dalam cairan ekstrasel, tetapi pada akhirnya dipekatkan dalm urin dan diekskresikan. Jika keseimbangan nitrogen dalam keadaan mantap ekskresi ureum kira-kira 25 mg per hari (Widman, 1995).

Ureum juga merupakan produk akhir dari metabolism nitrogen yang penting pada manusia, yang disintesis dari ammonia, karbon dioksida dan nitrogen amida aspartat (Murray et. al., 2003).

Definisi lain dari ureum adalah hasil akhir metabolisme protein. Berasal dari asam amino yang telah dipindah amonianya di dalam hati dan mencapai ginjal, dan diekskresikan rata-rata 30 gram sehari. Kadar ureum darah yang normal adalah 20 mg ~ 40 mg setiap 100 ccm darah, tetapi hal ini tergantung dari jumlah normal protein yang di makan dan fungsi hati dalam pembentukan ureum (Dyan, 2005).

Rumus bangun ureum:

Rumus molekul ureum adalah , dengan berat molekul 60 (Bishop et. al., 2000).

Metabolisme ureum terjadi dengan rangkaian sebagai berikut. Gugusan amino dilepas dari asam amino bila asam amino ini didaur ulang menjadi sebagian dari protein atau dirombak dan dikeluarkan dari tubuh, aminotransferase yang ada di berbagai jaringan mengkatalisis pertukaran gugusan amino antara senyawa-senyawa yang ikut serta dalam reaksi-reaksi sintetsis. Deaminasi oksidatif memisahkan gugusan amino dari molekul aslinya dan gugusan amino yang dilepaskan itu diubah menjadi ammonia. Amonia diangkut ke hati dan diubah menjadi reaksi-reaksi bersambung. Hampir seluruh urea dibentuk di dalm hati, dari katabolisme asam-asam amino dan merupakan produk ekskresi metabolisme protein yang utama. Konsetrasi urea dalam plasma darah terutama menggambarkan keseimbangan antara pembentukkan urea dan katabolisme protein serta ekskresi urea oleh ginjal : sejumlah urea dimetabolisme lebih lanjut dan sejumlah kecil hilang dalam keringat dan feses (Baron, 1995).

Berikut merupakan kelainan-kelainan yang terjadi berdasarkan kadar urea plasma :

1.      Urea Plasma yang tinggi (Azotemia)

Urea plasma yang tinggi merupakan salah satu gambaran abnormal yang utama dan penyebabnya diklasifikasikan sebagai berikut :

·        Peningkatan katabolisme protein jaringan disertai dengan keseimbangan nitrogen yang negative. Misalnya terjadi demam, penyakit yang menyebabkan atrofi, tirotoksikosis, koma diasbetika atau setelah trauma ataupun operasi besar. Karena sering kasus peningkatan katabolisme protein kecil, dan tidak ada kerusakan ginjal primer atau sekunder, maka ekskresi ke urin akan membuang kelebihan urea dan tidak ada keanikan bermakna dalam urea plasma.

·        Pemecahan protein darah yang berlebihan Pada leukemia, pelepasan protein leukosit menyokong urea plasma yang tinggi.

·        Pengurangan ekskresi urea Merupakan penyebab utama dan terpenting bias prerenal, renal atau postrenal. Penurunan tekanan darah perifer adatau bendungan vena atau volume plasma yang rendah dan hemokonsentrasi, mengurangi aliran plasma ginjal. Filtrasi glomelurus untuk urea turun dan terdapat peningkatan urea plasma, pada kasus yang ringan, bila tidak ada kerusakan struktur ginjal yang permanen, maka urea plasma akan kemabli normal bila keadaan prerenal dipulihkan ke yang normal.

·        Penyakit ginjal yang disertai dengan penurunan laju filtrasi glomelururs yang menyebabkan urea plasma menjadi tinggi.

·        Obstruksi saluran keluar urin menyebabkan urea plasma menjadi tinggi (Baron, 1995).

2.      Urea plasma yang rendah (Uremia)

Uremia kadang-kadang terlihat pada kehamilan, bias karena peningkatan filtrasi glomelurus, diversi nitrogen ke foetus atau karena retensi air. Pada nekrosis hepatic akuta, sering urea plasma rendah karena asam-asam amino tak dimetabolisme lebih lanjut. Pada sirosis hepatis, urea plasma yang rendah sebagian disebabkan oleh kecepatan anabolisme protein yang tinggi, bias timbul selama pengobatan dengan androgen yang intensif, juga pada malnutrisi protein jangka panjang (Baron, 1995).

Ureum digunakan untuk menentukan tingkat keparahan status azotemia/uremia pasien, menentukan hemodialisis (BUN serum . 40 mmol/l atau lebih dari 120 mg). Hemodialisis tidak adekuat apabila rasio reduksi ureum ,65%. Reduksi ureum yang tidak adekuat tersebut meningkatkan angka mortalitas pasien hemodialisa. Penurunan BUN (,50 ml/dl predialisis tidak menunjukkan dialysis yang baik, tetapi justru adanya malnutrisi dan penurunan massa otot karena dialysis inadekuat (Nyoman, 2008).

Kadar ureum dalam serum/ plasma mencerminkan keseimbangan antara produksi dan ekskresi. Metode penetapan adalah dengan mengukur nitrogen, di Amerika Serikat hasil penetapan disebut sebagai nitrogen ureum dalam darah (Blood Urea Nitrogen, BUN). Dalam serum normal konsentrasi BUN adalah 8-25 mg/dl, dan kadar ureum dalam serum normal adalah 10-50 mg/dl. Nitrogen menyusun 28/60 bagian dari berat ureum, karena itu konsentrasi ureum dapat dihitung dari BUN dengan menggunakan factor perkalian 2,14 (Widman, 1995).

Nilai rujukan kadar ureum plasma :

·        Usia <1 thn            : 4-19 mg/dL

·        Usia 1-17 thn        : 5-18 mg/dL

·        Usia 18-60 thn      : 6-20 mg/dL

·        Usia 61-90 thn      : 8-23 mg/dL

·        Usia >90 thn          : 10-31 mg/dL (Prodia, 2010).

Ginjal merupakan salah satu organ yang penting bagi makhluk hidup. Ginjal memiliki berbagai fungsi seperti pengaturan keseimbangan air dan elektrolit, pengaturan konsentrasi osmolalitas cairan tubuh dan konsentrasi elektrolit, pengaturan keseimbangan asam-basa, ekskresi sisa metabolisme dan bahan kimia asing; pengatur tekanan arteri, sekresi hormon, dan glukoneogenesis. Jika ginjal dibagi dua dari atas ke bawah, akan terlihat dua bagian utama yaitu korteks di bagian luar dan medulla di bagian dalam. Unit terkecil dari ginjal adalah nefron. Ginjal tidak dapat membentuk nefron baru sehingga apabila terjadi trauma pada ginjal, penyakit ginjal, atau terjadi penuaan normal, akan terjadi penurunan jumlah nefron secara bertahap (Guyton, 2006).

Sebagian besar penyakit ginjal menyerang nefron, menyebabkan mereka kehilangan kapasitas penyaringan mereka. Kerusakan pada nefron bisa terjadi dengan cepat, sering sebagai akibat dari cedera atau keracunan. Tetapi penyakit ginjal yang paling merusak nefron adalah yang perlahan-lahan dan diam-diam. Hanya setelah tahunan atau bahkan puluhan tahun akan terlihat jelas kerusakannya. Sebagian besar penyakit ginjal menyerang kedua ginjal secara bersamaan (NIDDK, 2009).

Dua penyebab paling umum dari penyakit ginjal adalah diabetes dan tekanan darah tinggi. Orang dengan riwayat keluarga apapun masalah ginjal juga di risiko untuk penyakit ginjal (NIDDK, 2009).Banyak faktor yang mempengaruhi kecepatan gagal ginjal yang tidak sepenuhnya dipahami. Para peneliti masih mempelajari bagaimana protein dalam diet dan tingkat kolesterol dalam darah mempengaruhi fungsi ginjal (NIDDK, 2009).

            Karena seseorang dapat memiliki penyakit ginjal tanpa gejala, dokter mungkin pertama mendeteksi kondisi melalui darah rutin dan tes urin. National Kidney Foundation merekomendasikan tiga tes sederhana untuk skrining penyakit ginjal: tekanan darah pengukuran, cek spot untuk protein atau albumin dalam urin, dan perhitungan laju filtrasi glomerulus (GFR) berdasarkan pengukuran kreatinin serum. Mengukur urea nitrogen dalam darah memberikan informasi tambahan (NIDDK, 2009).

IV.         Alat dan Bahan

A.     Alat

1.      Beaker Glass

2.      Kuvet

3.      Pipet Piston

4.      Spektrofotometer UV-Vis Single beam

B.     Bahan

1.      Larutan ureum standard:                                    50 mg/dL (8,33 mmol/L)

2.      Sampel : serum ureum

3.      Pereaksi 1:

a.       TRIS ph 7,8                                            150 mmol/L

b.      2-Oxoglutarate                                        9 mmol/L

c.       ADP                                                       0,75 mmol/L

d.      Urease                                                         ≥ 7 kU/L

e.       GLDH (Glutamate dehydrogenase)               ≥ 1 kU/L

Pereaksi 2:                                    

a.    NADH                                                      1,3 mmol/L

C.   Gambar

V.            Prosedur

 Larutan blangko, standar, dan sampel disiapkan dengan cara: ke dalam kuvet dimasukkan larutan reagent 1 sebanyak 1000 μL dengan menggunakan pipet piston. Larutan standar dipipet dengan pipet piston sebanyak 10μL, lalu dimasukkan ke dalam kuvet. Lalu ke dalamnya ditambahkan reagent 1 sebanyak 1000 μL. Larutan sampel dipipet dengan pipet piston sebanyak 10μL, lalu dimasukkan ke dalam kuvet. Lalu ke dalamnya ditambahkan reagent 1 sebanyak 1000 μL. Sampel dibuat secara duplo. Setelah itu, masing-masing diinkubasikan selama 5 menit, kemudian masing-masing ditambahkan reagent 2 sebanyak 250 μL. Setelah itu, campuran blanko, standar, dan sampel diinkubasikan kembali selama 1 menit. Absorbansinya kemudian diukur dengan alat spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 340 nm. Pertama, diukur blanko terlebih dahulu kemudian ditara. Setelah itu, absorbansi masing-masing dari standar dan sampel diukur. Proses pengukuran dilakukan tiap 1 menit hingga menit ke tiga setelah inkubasi. Selanjutnya absorbansi dicatat, lalu dihitung konsentrasi urea dalam sampel melalui rumus perhitungan.

VI.         Data Pengamatan dan Perhitungan

A.     Data Pengamatan

Kelompok	Sampel	Standar			Sampel
		A1	A2	∆A	A1	A2	∆A
I	1	0,134	0,168	0,034	0,337	0,763	0,426
	2				0,395	0,544	0,149
II	1				0,378	0,380	0,002
	2				0,419	0,678	0,259
III	1				0,319	0,105	0,214
	2				0,264	0,257	0,007
IV	1				0,160	0,303	0,143
	2				0,229	0,475	0,246

B.     Perhitungan

1.      ∆A
Sampel I         : ∆A = 0,160 – 0,303 = 0,143

Sampel II       : ∆A = 0,229 – 0,475 = 0,246

2.      Kadar Urea

Urea (mg/dl) =

Sampel I =  = 197,06 mg/dl

Sampel I =  = 361,76 mg/dl

Rata-Rata =  = 279,41 mg/dl

VII.      Pembahasan

Percobaan kali ini adalah melakukan pemeriksaan fungsi ginjal dengan test urea secara kinetika enzimatis dan menginterpretasikan hasil pemeriksaan yang diperoleh. Ureumdapat dijadikan salah satu parameter kerusakan ginjal karena ureum merupakan hasil akhir metabolisme protein di dalam hati, dimana amonia bereaksi dengan karbondioksida (CO2) hasil respirasi sel dalam tubuh akan menghasilkan ureum yang mencapai ginjal dan diekskresikan rata-rata 30 gram sehari. Apabila eksresi ureum abnormal, maka fungsi ginjal dapat diidentifikasi.

Langkah pertama pengerjaan uji kadar ureum dalam sampel adalah penyiapan reagen. Reagen diinkubasikan dengan alat pemanas hingga suhunya mencapai 37°C. Alasan digunakan suhu 37°C adalah karena suhu ini merupakan suhu yang optimal untuk reaksi antara reagensia dengan larutan sampel.

Langkah kedua, dibuat larutan blanko (A), sampel (B) dan standar (C) dengan dimasukkan sebanyak 1000 µl reagen I ke dalam tiga buah kuvet (A), (B), dan (C), lalu ditambahkan 10 µl sampel pada kuvet (B) dan 10 µl standar ureum pada kuvet (C) dengan menggunakan mikropipet dan dikocok perlahan agar homogen. Alasan penggunaan mikropipet karena memilki keakuratan yang baik untuk penambahan cairan dalam skala mikroliter (µl). Tip yang digunakan harus diperhatikan kebersihannya unuk meminimalisir kontaminasi yang mempengaruhi absorbansi sampel. Kemudian campuran larutan diinkubasi selama 5 menit untuk memberi waktu reaksi antara reagen I dengan sampel (B) atau standar (C).

Reagen I yang digunakan berisi TRIS ph 7,8 150 mmol/L, 2-oxoglutarate 9mmol/L, ADP 0,7 mmol/L, urease ≥ 7 kU/L, GLDH (Glutamate Dehidrogenase) ≥ 1 kU/L. TRIS ph 7,8 150 mmol/L  berfungsi sebagai dapar yang menjaga pH serum selama reaksi pemeriksaan ini. Urease berfungsi sebagai enzim yang mengkatalis pembentukan ammonia dari urea. Oxoglutarate akan beraksi dengan ammonia dan NADH membentuk L-glutamate dengan dikatalis oleh enzim GLDH. Selanjutnya, kedalam tiap kuvet ditambahkan reagen II sebanyak 250 µl, dikocok perlahan dan diinkubasi selama 1 menit agar reaksi campuran larutan sempurna. Reagen II berisi NADH 50 mg/dL. NADH akan mengalami oksidasi menjadi NAD⁺. Banyaknya NADH yang dioksidasi menjadi NAD⁺ sebanding dengan banyaknya ureum yang dianalisis secara fotometri.

 Langkah ketiga, dilakukan pengukuran absorbansi blanko, sampel, standar menggunakan instrument spektrofotometer UV-Vis. Instrument ini digunakan karena campuran larutan dapat memberikan absorbansi terhadap sinar visible yang dilewatkan melalui kuvet saat diletakkan didalam instrument. Selain itu, dilakukan pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer UV/Vis karena mempunyai sensitivitas yang relative tinggi, pengerjaanya mudah sehingga pengukuran yang dilakukan cepat, dan mempunyai spesifisitas yang baik.

 Kuvet yang berisi larutan blanko dimasukkan ke dalam Spektrofotometer UV/Vis untuk diukur absorbansinya. Larutan blanko berisi reagen I dan II tanpa adanya sampel dan perlakuannya pada kondisi yang sama dengan larutan berisi sampel/standar. Blanko ini berfungsi supaya alat spektrofotometer UV/Vis mengenal matriks selain sampel sebagai pengotor. Kemudian setting blank sehingga ketika pengukuran hanya sampel yang diukur absorbansinya. Setelah itu, kuvet yang berisi sampel dimasukkan ke tempat kuvet dan dilihat absorbansinya pada layar readout. Absorbansi tersebut dicatat sebagai nilai absorbansi pertama (A1). Kemudian 1 menit setelah pengukuran absorbansi pertama (A1), larutan kembali diukur absorbansinya dan nilai absorbansi yang dihasilkan dicatat sebagai nilai absorbansi kedua (A2). Pengukuran absorbansi larutan sampel (B) dan larutan standar (C) dilakukan dengan prosedur yang sama. Larutan sampel (B) diukur absorbansinya secara duplo untuk menambah keakuratan hasil pengukuran.  Sebelum pengukuran absorbansisampel/standar, harus dilakukan blanko terlebih dahulu.

Selama proses pemeriksaan ini, bagian bening kuvet  tidak boleh disentuh oleh tangan karena sumber sinar akan diteruskan melalui bagian bening kuvet. Jika bagian bening kuvet terkontaminasi oleh tangan, maka akan mempengaruhi nilai absorbansi. Hal ini akan memungkinkan kesalahan dalam menginterpretasikan data yang diperoleh. Pada prinsipnya, suatu molekul yang dikenai suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai akan menyerap energy dan energi molekul tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, sehingga terjadi peristiwa penyerapan (absorpsi) energi oleh molekul. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, dan jumlah cahaya yang diabsorpsi berbanding lurus dengan konsentrasinya sesuai hukum lambert-beer.

Langkah keempat, dari data absorbansi yang diperoleh, dicari kadar ureum dengan rumus sebagai berikut:

diperoleh hasil kadar ureum rata-rata dalam sampel sebesar 279,41 mg/dl. Kadar ini diluar batas normal karena berdasarkan literatur rentang kadar ureum darah normal antara 15-40 mg/dl.

Pemeriksaan kadar ureum dan kreatinin dalam darah dapat menjadi acuan untuk mengetahui adanya gagal ginjal akut, yaitu suatu sindrom klinis yang ditandai dengan penurunan kecepatan penyaringan ginjal, disertai dengan penumpukan sisa metabolism ginjal (ureum dan kreatinin). Hasil metabolisme yang akan dibuang oleh ginjal yaitu ureum dan kreatinin. Kedua zat ini dapat digunakan sebagai indikator derajat kesehatan pada ginjal. Apabila kadar keduanya meningkat, hal ini menunjukkan fungsi ginjal yang tidak baik.

Kadar ureum darah normal adalah 15 – 40 mg/dl, tetapi hal ini tergantung dari jumlah protein yang dimakan dan fungsi hati dalam pembentukan ureum. Kadar ureum dapat meningkat pada orang dengan intake diet protein besar dan dapat menurun pada orang dengan intake diet protein kecil. Zat ini dipekatkan dalam urin untuk diekskresikan. Kadar dalam darah mencerminkan keseimbangan antara produksi dan ekskresi urea.  Jika terdapat kerusakan pada ginjal dan glomerulus filtration rate (kecepatan filtrasi glomerulus) menurun, maka ureum tidak dapat dikeluarkan bersama urin serta tertahan lebih lama di dalam darah. Hal ini akan menyebabkan kadar urem dalam darah meningkat.

Dalam praktikum ini, kadar ureum diukur dengan metode kolorimetri menggunakan spektrofotometer UV-Vis atau analyzer kimiawi. Pengukuran berdasarkan atas reaksi enzimatik dengan diasetil monoksim yang memanfaatkan enzim urease yang sangat spesifik terhadap ureum. Konsentrasi ureum umumnya dinyatakan sebagai kandungan nitrogen molekul, yaitu nitrogen urea darah (blood urea nitrogen, BUN).

Sehingga dari hasil pemeriksaan dapat disimpulkan bahwa pasien kemungkinan mengalami gagal ginjal akut, karena hasil analisis menunjukkan bahwa kadar ureum pada sampel plasma pasien diatas normal (15-40 mg/dl). Namun hasil dari pemeriksaan kadar ureum tidak dapat digunakan sebagai acuan utama karena kadar ureum sangat dipengaruhi intake makanan. Untuk lebih pasti perlu dilakukan pemeriksaan terhadap kadar kreatinin dalam darah karena kreatinin hanya dieksresikan melalui ginjal serta kadar kreatinin hanya dipengaruhi oleh metabolisme otot yang relatif stabil sehingga hasil pemeriksaan yang diperoleh lebih akurat untuk pemeriksaan fungsi ginjal. Apabila hasil keduanya diatas batas normal, maka dapat dipastikan bahwa pasien mengalami gagal ginjal akut.

VIII.   Kesimpulan

1.        Pemeriksaan fungsi ginjal dapat dilakukan dengan test urea, sampel direaksikan dengan reagen kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 340 nm.

2.    Dari hasil pemeriksaan kadar ureum dalam sampel sebesar 279,41 mg/dL. Hal ini menunjukkan bahwa kadar uerum dalam sampel tinggi sehingga diindikasikan terjadi gangguan pada fungsi ginjal.

DAFTAR PUSTAKA

Baron, D. N, 1995. Kapita Selekta Patologi Klinik (A Short Text Book of Chemical Pathology) Edisi 4. EGC. Jakarta.

Bishop L. Michael, Duben L, Janet – Kirk Engelel, Fody P. Edward. 2000. Clinical Chemistry: Principles, Procedures, Correlations Edisi 4. Lippincott Williams & Willkins (A Wolters Kluwer Company). Baltimore.

Dyan. 2005. Ureum dan Kreatinin. Available online at http://dyanelekkodhog.blogspot.com/2011/09/ureum-dan-kreatinin.html [Diakses tanggal 8 Mei 2013].

Guyton, Arthur C. 2006. Fisiologi Kedokteran. EGC. Jakarta.

Murray, Robert, K. Darylk, Granner, Peter, A. mayos, Victor, W. Rodwell. 2003. Biokimia Harper. EGC. Jakarta.

NIDDK. 2009. The Kidneys and How They Work. Available online at  http://kidney.niddk.nih.gov/Kudiseases/pubs/yourkidneys/ [Diakses tanggal 21 April 2013]

Nyoman, Suci W. 2008. Kadar Ureum dalam Penderita Gagal Ginjal yang Menjalani Terapi Hemodialisis. Available online at          http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/105/jtptunimus-gdl-tantikurni-5215-                        2-bab2.pdf [Diakses tanggal 8 Mei 2013].

Prodia. 2010. Urea-N. Available online at http://prodia.co.id/kimia/urea-n [Diakses tanggal 8 Mei 2013].

Widman, Frances K. 1995. Tinjauan Klinis Atas Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Edisi 9. Terj. : Gandasoebroto, et al. EGC. Jakarta.