More Text

Unordered List

Unordered List

BTricks

BThemes

Diberdayakan oleh Blogger.

Mengenai Saya

Foto Saya

Just An Ordinary People
But I Have A Dream
And Someday, I Believe The Dream Will Be Come True :D

Selasa, 04 Juni 2013

Laporan Praktikum Identifikasi dan Penentuan Kadar Senyawa Rhodamin B Dalam Sampel Lipstik | Analisis Farmasi



Identifikasi dan Penentuan Kadar Senyawa Rhodamin B Dalam Sampel Lipstik BerMerk Dagang Menggunakan KLT dan Spektrofotometri UV-Vis




I.                   TUJUAN
1.      Identifikasi senyawa rhodamin B pada lipstik dengan menggunakan KLT.
2.      Identifikasi senyawa rhodamin B pada lipstik dengan menggunakan Instrumen Spektrofotometer UV-Vis

II.                PRINSIP
1.      KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
Adalah suatu teknik pemisahan yang sederhana menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap atau lapisan tipis  dan kering berbentuk silika, alumina , selulosa ataupun polianida.
2.      Spektrofotometri UV-Vis
Adalah suatu metode analisis menggunakan prinsip penyerapan gelombang 100 – 400 nm dan 400 – 800 nm oleh molekular senyawa.
3.      Hukum Lambert-Beer
Menyatakan bahwa konsentrasi suatu zat berbanding lurus dengan jumlah cahaya yang diabsorbsi, atau berbanding terbalik dengan logaritma cahaya yang ditransmisikan.
                      A = a . b . c = log   = 2 – log %T
         Dimana :            A          = absorban
                                   a          = absorbtivitas
                                   b          = jalannya sinar pada larutan
                                   c          = konsentrasi larutan
%T       = persen transmitan


III.             TEORI DASAR

A.     Rhodamin B
Rhodamin B adalah salah satu zat pewarna sintetis yang biasa digunakan pada industri tekstil dan kertas . Zat ini ditetapkan sebagai zat yang dilarang penggunaannya pada makanan melalui Menteri Kesehatan (Permenkes) No.239/Menkes/Per/V/85. Namun penggunaan Rhodamine dalam makanan masih terdapat di lapangan. Contohnya, BPOM di Makassar berhasil menemukan zat Rhodamine-B pada kerupuk, sambak botol, dan sirup melalui pemeriksaan pada sejumlah sampel makanan dan minuman. Rhodamin B ini juga adalah bahan kimia yang digunakan sebagai bahan pewarna dasar dalam tekstil dan kertas. Pada awalnya zat ini digunakan untuk kegiatan histologi dan sekarang berkembang untuk berbagai keperluan yang berhubungan dengan sifatnya dapat berfluorensi dalam sinar matahari (Hamdani, 2013)
Rumus Molekul dari Rhodamin B adalah C28H31N2O3Cl dengan berat molekul sebesar 479.000.

 Zat yang sangat dilarang penggunaannya dalam makanan ini berbentuk kristal hijau atau serbuk ungu-kemerah – merahan, sangat larut dalam air yang akan menghasilkan warna merah kebiru-biruan dan berfluorensi kuat. Rhodamin B juga merupakan zat yang larut dalam alkohol, HCl, dan NaOH, selain dalam air. Di dalam laboratorium, zat tersebut digunakan sebagai pereaksi untuk identifikasi Pb, Bi, Co, Au, Mg, dan Th dan titik leburnya pada suhu 165?C (Hamdani, 2013).
Dalam analisis dengan metode destruksi dan metode spektrofometri, didapat informasi bahwa sifat racun yang terdapat dalam Rhodamine B tidak hanya saja disebabkan oleh senyawa organiknya saja tetapi juga oleh senyawa anorganik yang terdapat dalam Rhodamin B itu sendiri, bahkan jika Rhodamin B terkontaminasi oleh senyawa anorganik lain seperti timbaledan arsen.Dengan terkontaminasinya Rhodamin B dengan kedua unsur tersebut, menjadikan pewarna ini berbahaya jika digunakan dalam makanan ( Hamdani, 2013).

B.     Kromatografi Lapis Tipis
Absorbsi dan partisi berdasarkan pada jumlah dan cara penotolan cuplikan yang berkesinambungan dengan hasil akhir membentuk pita. Kromatografi lapis tipis preparative merupakan metode isolasi dari suatu simplisia untuk mendapatkan senyawa tunggal (Agustina, 2009).
Lapisan preparatif normalnya adalah lapisan KLT  yang  lebih tebal dari 0,5. Seperti aturan umumnya dimana ketebalan maksimumnya adalah 2 mm meskipun beberapa pengerjaan melibatkan penggunaan lempeng yang tebalnya mencapai 10 mm. Pembuatan lempeng KLTP haruslah resisten terhadap abrasi. KLTP dibahas dalam beberapa literatur dimana metode ini masih menjadi metode yang populer. Ada perbedaan utama antara KLTP dan KLT konvensional : (15: 54)
1.         Sampel ditotolkan berupa pita, biasanya bila memungkinkan ditotolkan selebar lempeng.
2.         Deteksi dari pemisahan senyawa biasanya dilakukan dengan absorbansi UV atau flouresensi.
3.         Biasanya multi elusi diperlukan untuk memperoleh resolusi pemisahan yang baik dari komponen sampel  
(Gritter et al, 1991).
Karena besarnya volume yang diaplikasikan pada KLTP bila dibandingkan dengan KLT, penggunaan alat penotolan seperti yang dibicarakan nanti diperlukan untuk keakuratan. Larutan sampel dapat ditotolkan sepanjang lempeng  KLTP. Ini memungkinkan jumlah maksimum volume yang ditotolkan (volume hingga 500  ml larutan dapat dicapai dengan penggunaan alat). Bagaimanapun juga sangat penting untuk membiarkan sekitar 2 cm dari ujung pita dengan tepi lempeng. Ini dapat menghindarkan efek tepi yang dapat terjadi selama pengembangan karena perbedaan ketebalan sorben pada tepi lempeng. Ketebalan dari lapisan dan kemampuan sampel untuk melintasi jarak dari lempeng menyebabkan miligram samapi satu berat yang sangat rendah dapat diaplikasikan tetapi sayangnya waktu pengembangan yang panjang tidak dapat dihindarkan dari penggunaan gaya kapilaritas normal. Biasanya pemisahan yang memakan waktu 30-60 menit pada KLT akan memakan waktu beberapa jam pada KLTP dengan lapisan setebal 2 mm. Ini tidak serta merta menjadi kerugian dari KLTP karena pemisahan dapat dilakukan semalaman dan kromatografer tidak perlu melakukan banyak hal selama pengembangan. Biasanya pemilihan eluen ditentukan berdasarkan percobaan KLT sebelumnya  (Sastrohamidjojo, 1985).

C.     Metode Adisi Standar
Ketika menggunakan kurva kalibrasi konvensional, maka harus diketahui bahwa perbandingan respon/konsentrasi adalah sama baik di dalam sampel maupun didalam larutan standar. Ada dua keadaan yang dapat menyebabkan ketidak-akuratan ketika menggunakan kurva kalibrasi, yaitu:
  1. Faktor-faktor yang berada didalam sample yang mengubah perbandingan respon/konsentrasi, tetapi faktor tersebut tidak ada didalam larutan standar (misalnya perubahan pH, kekuatan ion, kekeruhan, viskositas, gangguan kimia dan lain lain). Faktor-faktor tersebut akan mengubah kemiringan (slope) kurva kalibrasi.
  2. Faktor yang tampak/kelihatan pada alat pendeteksi misalnya warna atau kekeruhan sample yang menyerap atau menghamburkan cahaya pada panjang gelombang pengukuran. Faktor ini tidak berpengaruh terhadap slope kurva kalibrasi (Wiryawan,2011).
Jika perbandingan respon/konsentrasi antara sampel dan larutan standar tidak sama, misalnya disebabkan oleh matrik atau komposisi yang berbeda antara sample dan standar, maka penggunakaan kurva kalibrasi untuk menentukan konsentrasi sampel akan memberikan hasil yang tidak akurat. Hal ini dapat diatasi dengan menggunakan metode adisi standar. Dengan menggunakan metode ini, kedalam sejumlah sampel ditambahkan larutan standar (konsentrasi diketahui dengan pasti) dengan volume yang bervariasi. Kemudian diencerkan hingga volumenya sama. Dengan demikian maka b aik matrik sampel maupun matrik standar adalah sama. Yang berbeda hanyalah konsentrasi standar yang ditambahkan pada sampel. Untuk lebih mudahnya, persiapan sampel dapat dilakukan seperti dalam Tabel11.1(misal konsentrasi larutan standar adalah 10 unit) (Roth etal, 1988).
Kurva adisi standar dari Tabel 11.1 dapat dilihat pada Gambar 11.8. Pada gambar tersebut, sumbu X adalah konsentrasi standar yang ditambahkan setelah pengenceran sampai 50.0 mL. Intersep yang diplotkan pada sumbu X merupakan nilai mutlak.

yang menunjukkan konsentrasi analit dalam sample setelah pengenceran sampai 50 mL, yaitu 1.3 unit. Dengan demikian konsentrasi sample sebelum diencerkan adalah sebesar 2.6 unit (1.3 unit x 50.0/25.0) (Wiryawan,2011).

Limit deteksi (LOD) adalah konsentrasi terkecil yang berbeda dari blangko yang secara statistik dapat dideteksi. LOD ini dihitung berdasarkan dua kali standar deviasi dari pengukuran sedikitnya 10 kali larutan blangko. Limit deteksi juga memberikan petunjuk kestabilan sistem intrumentasi secara menyeluruh, dimana LOD ini akan berbeda-beda untuk intrumentasi yang satu dengan lainnya. Bahkan LOD dari satu intrumentasi dapat berbeda dari hari ke hari. Karakteristik konsentrasi (sering juga disebut sebagai sensitivitas) untuk 1% absorpsi adalah konsentrasi dari suatu elemen yang memberikan pembacaan 0.0044 unit absorban. Karakteritik konsentrasi tergantung pada beberapa faktor misalnya efisiensi atomisasi, efisiensi nyala, dan noise. Gambar11.9 meng-ilustrasi-kan perbedaan antara sensitivitas dan limit deteksi. Gambar11.9A maupun 11.9B memiliki sensitivitas yang sama, akan tetapi limit deteksi B lebih baik di bandingkan A.


IV.               ALAT DAN BAHAN
A.     Alat
 batang pengaduk
penangas air
Beaker glass
pipet tetes
bulb pipet
pipet volume
chamber
silica gel
gelas ukur
spatel
kaca arloji
spektrofotometer uv-vis
kuvet
timbangan analitik
labu ukur


B.     Bahan
1.      Ammonia

2.      Baku pembanding Rhodamin B
3.      Etil asetat
4.      HCl 4 M
5.      Methanol
6.      Na-Sulfat Anhidrat
7.      Sampel lipstik




V.  PROSEDUR

A.     Kualitatif
1.      Pembuatan larutan uji (Larutan A)
Ditimbang sebanyak 2 g sampel, kemudian ditambahkan 4 tetes HCl 4 M dan 5 ml methanol. Dipanaskan selama 5 menit hingga sampel melarut. Selanjutnya ditambahkan methanol ad 30 ml, disaring dengan kertas saring, dan ditambahkan Na-sulfat anhidrat kedalamnya. Filtrat diambil dan dimasukkan kedalam botol vial.
2.      Pembuatan larutan baku (Larutan B)
Ditimbang sebanyak 5 mg pewarnaa rhodamin B baku pembanding. Dilarutkan dalam 10 mL methanol, dikocok hingga larut.
3.      Pembuatan larutan C
Dipipet sejumlah volume yang sama antara larutan A dan larutan B. dicampur dan dihomogenkan.
4.      Uji identifikasi sampel
Plat KLT disiapkan, kemudian ditotolkan larutan baku dan larutan sampel secara terpisah. Didiamkan plat KLT hingga mongering. Kemudian plat KLT dimasukkan kedalam chamber yang telah dijenuhkan dengan propanol : ammonia (90 : 10). Dibiarkan fasa gerak nya naik hingga batas pelat, dan dikeringkan. Selanjutnya diamati noda dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. Warna merah berfluoresensi kuning menunjukkan adanya rhodamin B.

B.     Kuantitatif
1.      Preparasi sampel
Ditimbang 2 g sampel, diletakkan diatas cawan penguap dan ditambah 16 tetes HCl 4 M, dimasukkan dalam beaker glass dan ditambahkan 30 ml methanol. Kemudian dilelehkan diatas penangas air hingga melarut. Disaring dengan kertas saring, dan ditambahkan Na-sulfat anhidrat dan disaring kembali.

2.      Pembuatan larutan baku
Dibuat larutan baku dari pewarna rhodamin B baku pembanding. Larutan baku yang dibuat memiliki konsentrasi sebesar 100 ppm.
3.      Standar adisi
Dibuat larutan dengan lima konsentrasi yang berbeda pada tiap-tiap labu ukur. Dipipet sampel sebanyak 0,3 ml kedalam lima buah labu ukur 25 ml yang berbeda. Pada masing-masing labu ukur, ditambahkan larutan baku pada berbagai volume yang berbeda, kemudian ditambahkan methanol hingga batas labu ukur. Selanjutnya dilakukan analisis dengan instrument spektrofotometer UV-Vis pada masing-masing konsentrasi, dicatat hasil absorbansinya.
4.      Perhitungan konsentrasi dan kadar
Dibuat kurva kalibrasi, ditentukan persamaan garisnya. Nilai a sampel dimasukkan kedalam persamaan garis, kemudian dihitung konsentrasi dan kadar sampelnya.
VI. DATA PAENGAMATAN DAN PERHITUNGAN
A.     Pembuatan HCl 37%
M =  
Pengenceran :
12 * X = 4 * 60
                              X= 20 ml

B.     Rf
Rf (std) = 4.2/5.7 = 0.74
Rf (sampel) = 3.9/5.2 = 0.75
C.     Pembuatan baku standar
25 mg dalam 250 ml = 25 mg / 250 ml = 100 ppm

D.    Pembuatan larutan sampel
Labu
I
II
III
IV
V
Sampel
0.3 ml
0.3 ml
0.3 ml
0.3 ml
0.3 ml
BPFI
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
pelarut
Add 25
Add 25
Add 25
Add 25
Add 25

Untuk labu I → diambil 1.1 mL→
Untuk labu II → diambil 1.2 mL→
Untuk labu III → diambil 1.3 mL→
Untuk labu IV → diambil 1.4 mL→
Untuk labu V → diambil 1.5 mL→

Absorbansi

x= V. baku (mL)
y = Absorbansi
a = 0.2187
b = 0.36175
r = 0.9684
y = 0.2187x + 0.36175

Kadar rhodamin dalam sampel
Cx



Kadar Rhodamine dalam lipstik
1153,6 ppm = 1153,6 μg/ml → 1.1536 mg/ml
Kadar rhodamine B (mg) = Cx × Vol. Filtrat sampel
=1.1536 mg/ml  × 50 ml
=  57,68 mg
Kadar rhodamine B (%) = konsentrasi x 25 = 13784,1 ppm x   = 34,46 %




VII.  PEMBAHASAN
Praktikum kali ini bertujuan untuk menganalisis Rhodamin b yang diduga terkandung dalam sampel lipstick. Analisis yang dilakukan yaitu analisis kualitatif dengan uji kromatografi lapis tipis dan analisis kuantitatif dengan spektrofotometri UV-Visible. Sampel lipstik yang digunakan adalah Quina, lipstik yang beredar di pasaran namun tidak memiliki nomor registrasi. Analisis ini dilakukan karena rhodamin b dalam kosmetik terutama lipstik perlu diawasi keberadaanya sebab rhodamin b merupakan pewarna sintesis yang biasa digunakan pada tekstil. Pengunaan rhodamin b dalam suatu sediaan dilarang karena dapat menimbulkan dampak yang tidak diharapkan seperti gangguan kesehatan.
Analisis kualitatif ini berfungsi untuk mengidentifikasi keberadaan rhodamin b dalam sampel lipstick, yaitu menggunakan Kromatografi Lapis Tipis yang merupakan salah satu teknik pemisahan senyawa dengan prinsip adsorpsi dan koefisien partisi. KLT dilakukan karena pengujian menggunakan metode ini mudah dilakukan dan murah. Prinsip kromatografi lapis tipis yaitu perbedaan kepolaran ‘like dissolve like’ dimana pelarut yang bersifat polar akan berikatan dengan senyawa yang bersifat polar juga dan sebaliknya. Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluent  maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
 Tahap pertama yang dilakukan adalah preparasi larutan sampel. Preparasi sampel dilakukan untuk memperoleh larutan sampel sehingga bisa dianalisis karena dalam KLT, sampel yang diuji harus berbentuk larutan. Sampel lipstik ditimbang sebanyak 500 mg secara seksama dan diletakkan di cawan penguap supaya preparasi mudah dilakuakan. Setelah itu sampel tersebut ditambahkan HCl 4 M. Larutan HCl 4 M ini digunakan untuk mendestruksi senyawa-senyawa yang ada di dalam sampel lipstik dan menstabilkan rhodamine agar tidak berubah dari bentuk terionisasi menjadi bentuk netral. Selanjutnya, ditambahkan 5 ml methanol. Fungsi methanol ini yaitu sebagai pelarut karena rhodamin b bersifat sangat mudah larut dalam alkohol.
Setelah ditambahkan pelarut, sampel dipindahkan ke beaker glass kecil dan ditutup dengan kaca arloji yang berfungsi untuk meminimalisir penguapan karena methanol bersifat mudah menguap, terlebih lagi jika dipanaskan. Beaker glass tersebut kemudian dipanaskan di atas penangas air. Tujuannya yaitu untuk mempercepat proses pelarutan lipstick yang berwujud padat hingga diperoleh larutan berwarna merah. Setelah diperoleh larutan berwarna merah, maka larutan kemudian difiltrasi dengan cara disaring dengan menggunakan kertas saring dan bantuan corong penyaring. Namun sebelumnya, larutan sampel ditambahkan dengan Natrium sulfat anhidrat. Fungsinya yaitu untuk menyerap air. Penyaringan ini dilakukan untuk memisahkan senyawa Rhodamin b yang akan dianalisis dari senyawa-senyawa pengotor yang dapat mengganggu absorbansi, misalnya basis lipstik. Filtrat yang diperolah ditampung dalam beaker glass bersih. Filtrat hasil penyaringan berupa larutan bening berwarna merah yang diduga berasal dari pewarna merah Rhodamin b. Setelah dibuat larutan sampel, maka dibuat larutan rhodamin-B BPFI dengan pelarut yang sama yaitu methanol. Larutan baku ini digunakan sebagai pembanding nilai Rf dalam KLT.
 Selanjutnya dilakukan penyiapan fasa diam dan fasa gerak dari sistem kromatografi lais tipis ini. Fasa diam yang digunakan adalah silica gel. Dalam fase diam terdapat plat tipis aluminium yang berfungsinya untuk tempat berjalannya adsorbens sehingga proses migrasi analit oleh solventnya bisa berjalan. Dalam KLT adsorbens yang digunakan berupa silika gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang tercipta lebih terfokus dan tajam. Fase diam ini bersifat polar. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah campuran propanol : amoniak (90:10) dengan total volume eluent yaitu 100 ml. Eluent yang digunakan bersifat lebih polar dari fase diamnya agar sampel yang polar tidak terikat kuat pada fase diamnya. Penggunaan eluent ini disesuaikan dengan sifar polar Rhodamin b karena memiliki gugus karboksil dengan pasangan elektron bebas dan gugus amina pada struktur molekulnya. Gugus karboksil dan amina ini akan membentuk ikatan hidrogen intermolekular dengan pelarut polar sehingga mudah larut dalam pelarut polar seperti alkohol Oleh karena itu, digunakan campuran eluen polar agar dapat mengeluasi Rhodamin b dengan baik.
Setelah dibuat eluent, maka larutan eluent tersebut dijenuhkan terlebih dahulu. Tujuan penjenuhan adalah untuk memastikan partikel fasa gerak terdistribusi merata pada seluruh bagian chamber sehingga proses pergerakan spot di atas fasa diam oleh fasa gerak berlangsung optimal, dengan kata lain penjenuhan digunakan untuk mengotimalkan naiknya eluent. Selain itu juga berfungsi untuk menghindari hasil tailing pada pelat KLT. Untuk mengetahui kejenuhan tersebut maka digunakan kertas saring yang disimpan diatas bagian dalam chamber. Kejenuhan ditandai dengan suhu di dalam chamber hangat serta lebabnya kertas saring.
Selama proses penjenuhan, dilakukan persiapan fase diam. Pelat aluminium yang digunakan berukuran 20 x 20 cm. Pelat tersebut diberi batas atas dan bawah masing-masing 1 cm. Fungsinya sebagai penanda jarak tempuh eluent. Batas bawah plat dibuat sedemikian rupa sehingga tidak terendam oleh eluent. Setelah itu, dilakukan penotolan larutan baku dan sampel menggunakan pipa kapiler. Tujuannya yaitu supaya penotolan kecil karena dalam KLT, penotolan yang baik diusahakan sekecil mungkin untuk menghindari pelebaran spot dan  jika sampel yang digunakan terlalu banyak akan menurunkan resolusi.. Pelebaran spot dapat mengganggu nilai Rf karena memungkinkan terjadinya himpitan puncak. Penotolan dilakukan pada garis bawah yang telah dibuat.  Kemudian dibiarkan beberapa saat hingga mengering. Penotolan plat juga tidak boleh terlalu berdekatan untuk menghindari bergabungnya spot masing-masing larutan dan tidak boleh terlalu pekat untuk menghindari adanya tailing saat spot naik bersama fasa gerak.
Selanjutnya, plat dimasukkan dengan hati-hati ke dalam chamber tertutup yang berisi fasa gerak dengan posisi fasa gerak berada di bawah garis. KLT ini menggunakan metode ascending (naik). Kemudian fase gerak dibairkan naik sampai hampir mendekati batas atas plat. Fase gerak perlahan-lahan bergerak naik. Meskipun melawan gravitasi, namun eluent bisa naik karena adanya afinitas. Dalam proses naiknya fase gerak, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda sesuai dengan kepolarannya. Setelah kira-kira mencapai jarak tempuh 6 cm,  plat KLT diangkat dan dibiarkan kering diudara. Tujuannya untuk menguapkan sisa pelarut yang masih terdapat pada plat untuk menjamin penguapan telah sempurna dan agar spot jelas terlihat.
Kemudian diamati dibawah sinar UV pada panjang gelomang 254 nm. UV254 tersebut merupakan deteksi universal yang bisa digunakan untuk senyawa yang berfluorsensi seperti rhodamin b. Hasilnya yaitu terbentuk 2 spot berfluoresensi berwarna merah muda kebiruan dengan jarak tempuh spot yang berdekatan. Namun, spot yang dianalisis adalah spot yang mirip dengan spot larutan baku Rhodamin b. Berdasarkan hasil pengukuran, diperoleh jarak spot dengan batas bawah yaitu 3,9 cm sedangkan jarak tempuh pelarut yaitu 5,2 cm. kemudian dilakukan perhitungan Rf dengan menggunakan rumus
Rf yang didapat dari hasil pengamatan yaitu 0.75. Nilai Rf menyatakan ukuran daya pisah suatu zat dengan kromatografi planar (KLT), dimana jika nilai Rf-nya besar berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent (eluenya) maksimum sedangkan jika nilai Rf-nya kecil berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent (eluenya) minimum. Rf yang optimum yaitu berada pada rentang 0.5 – 0.8.
Rf sampel kemudian dibandingkan dengan Rf baku. Dalam larutan baku, jarak spot dengan batas bawah yaitu 4,2 dan jarak tepuh pelarut yaitu 5,7 sehingga diperoleh Rf yaitu 0.74. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa Rf sampel yang dianalisis berdekatan dengan Rf baku. Hal ini mengindikasikan bahwa sampel lipstick mengandung Rhodamin b.  .
Dalam KLT, faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pemisahan komponen adalah struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan, sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya, tebal dan kerataan zat penyerap, kemurnian pelarut, derajat kejenuhan, teknik percobaan, jumlah cuplikan, temperatur, dan kesetimbangan.
Selain uji kualitatif, dilakukan juga uji kuantitatif. Analisis kuantitatif ini bertujuan untuk mengetahui kadar rhodamin b dalam sampel lipstick karena berdasakan uji kualitatif, sampel mengandung rhodamin b. Analisis kuantitatif yang dilakukan adalah spektrofotometri UV-Vis. Metode spektrofotometri ini mempunyai prinsip yaitu hukum lambert beer. Hukum lambert beer menyatakan konsentrasi suatu zat berbanding lurus dengan jumlah cahaya yang diabsorbsi, atau berbanding terbalik dengan logaritma cahaya yang ditransmisikan.  Dengan demikian, dari pengukuran spektrofotometri dapat dihitung konsentrasi sampel yang dianalisis.
Alasan menggunakan metode analisis spektrofotometri UV-Vis adalah karena senyawa rhodamin b memiliki gugus kromofor yaitu gugus dalam senyawa organik yang mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak seperti gugus karboksil, senyawa aromatik dan juga memiliki gugus auksokrom yaitu gugus yang memiliki pasangan elektron bebas seperti NR2. Alasan lain, yaitu karena metode ini mudah dilakukan.
Hal pertama yang dilakukan adalah pembuatan larutan baku. Untuk larutan baku, dibuat sejumlah 25 mg rhodamin b BPFI ditimbang seksama kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL, ditambah dengan pelarut methanol hingga batas labu dan dikocok hingga larutan homogen. Hasilnya yaitu terbentuk larutan pink bening dengan konsentrasi 100 ppm. Setelah dibuat larutan baku, lalu dibuat larutan sampel. Prosedur dan bahan preparasi sampel sama seperti pada analisis kualitatif, yang berbeda hanya jumlah sampel. Untuk analisis kuantitatif, sampel lipstick yang digunakan yaitu sebanyak 2 gram ditambah HCl 16 tetes dan pelarut methanol sebanyak 60 mL. Setelah dipanaskan dan disaring dengan tambahan Na-Sulfat, maka diperoleh filtrat sebanyak 50 mL berwarna merah terang.
Analisis kuantitatif ini menggunakan metode standar adisi karena standar adisi biasa digunakan untuk mengukur sampel yang konsentrasinya kecil. Pada percobaan, senyawa yang dianalisis adalah rhodamin b dalam sediaan kosmetik lipstick. Konsentrasi rhodamin b dalam sampel lipstick diperkirakan kecil karena seharusnya rhodamin b tidak digunakan untuk pewarna sediaan kosmetik. Oleh karena itu, untuk bisa mengukur konsentrasinya dipilih metode standar adisi. Alasan lain yaitu karena metode standar adisi lebih akurat.
Pada dasarnya, metode standar adisi dilakukan dengan menambahkan sejumlah larutan standar dengan volume yang bervariasi ke dalam sejumlah sampel. Kemudian diencerkan hingga volumenya sama. Dengan demikian matrik sampel dan matrik standar sama, yang berbeda yaitu konsentrasi standar yang ditambahkan pada sampel. Sesuai metode standar adisi, prosedur yang dilakukan yaitu ke 5 labu ukur masing-masing dimasukkan larutan sampel dengan volume yang sama yaitu 0.3 ml. Kemudian dimasukkan larutan baku dengan volume berbeda sehingga menghasilkan variasi konsentrasi yaitu 1.1 mL (4.4 ppm), 1.2 mL (4.8 ppm), 1.3 mL (5.2 ppm), 1.4 mL (5.6 ppm), dan 1.5 mL (6 ppm). Kemudian add ke dalam labu tersebut methanol hingga tanda batas. Semua larutan tersebut dikocok supaya larutan homogeny. Dalam percobaan digunakan labu ukur karena analisis bersifat kuantitatif.
Larutan ini kemudian diukur pada panjang gelombang, suhu, kuvet dan kondisi pelarut yang sama, karena jika dilakukan dalam kondisi yang berbeda maka akan memberikan nilai pengukuran yang berbeda-beda dan tidak memenuhi Hukum Lambert-Beer. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang memberikan absorbansi maksimum karena pada panjang gelombang serapan maksimum, kepekaannya juga maksimum. Selain itu disekitar panjang gelombang  serapan maksimum, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum lambert-beer akan terpenuhi serta jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali.
Penentuan panjang gelombang maksimum pada rhodamin b dilakukan pada rentang panjang gelombang 400-800 nm. Hal ini dilakukan karena larutan rhodamin b merupakan larutan berwarna sehingga dipilih sinar tampak yang mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Selain itu pengukuran dilakukan pada rentang tersebut karena hukum Lambert-Beer terpenuhi. Hasil penentuan panjang gelombang dengan serapan maksimum larutan rhodamin b  diperoleh l pada 544 nm. Menurut literatur, panjang gelombang ini sama dengan panjang gelombang untuk rhodamin b.
Sebelum melakukan pengukuran, dilakukan blanko terlebih dahulu. Blanko yaitu pengukuran absorbansi pelarut yang digunakan, yaitu methanol. Tujuannya adalah supaya alat mengenali pelarut sebagai pengotor. Absorbansi dari pelarut tersebut dinolkan. Dengan demikian, pengukuran absorbansi sampel rhodamin b tidak akan dipengaruhi oleh absorbansi pelarutnya. Kemudian  masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam kuvet. Kuvet yang digunakan harus bersih dan kering sebelum dimasukkan ke dalam alat spektro dan sisi kuvet yang bening tidak boleh disentuh untuk meminimalisir kontaminasi dari jari tangan karena bagian sisi kuvet tersebut akan terkena sumber sinar. Hal tersebut dilakukan untuk mencegah kesalahan pembacaan absorbansi. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang maksimum yaitu 544 nm. Setelah kuvet dimasukkan, dipilih start measurement. Dalam proses ini, alat spektro menembakkan energi dengan panjang gelombang tertentu pada senyawa rhodamin b yang dianalisis. Hal ini membuat elektron senyawa akan tereksitasi ke orbital yang lebih tinggi. Setelah mengalami eksitasi, elektron tersebut akan turun kembali ke ground state (keadaan dasar), sambil melepaskan emisi yang akan terukur oleh detektor. Output yang dihasilkan berupa absorbansi.
Dari hasil pengukuran diperoleh absorbansi yang berbeda-beda pada setiap konsentrasi. Pada labu 1 diperoleh absorbansi rata-rata 0.606, absorbansi labu 2 yaitu 0.6133, absorbansi labu 3 yaitu 0.6583, absorbansi labu 4 yaitu 0.6644, dan absorbansi labu 5 yaitu 0.6893. Dalam hal ini, absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi. Peningkatan konsentrasi diikuti dengan peningktan absorbansi, meskipun peningkatannya tidak konstan. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplot menjadi kurva standar adisi. Fungsi x dalam kurva yaitu volume standar dan fungsi y sebagai absorbansi yang dihasilkan.
Berdasarkan kurva diperoleh persamaan garis  dengan koefisien korelasi 0.9684. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kurva tersebut tidak linear. Hal ini dapat disebabkan karena adanya kesalahan dalam proses pengenceran sehingga konsentrasinya tidak sesuai atau adanya kontaminan yang mengganggu pengukuran absorbansi. Koefisien korelasi menunjukkan korelasi liner antara konsentrasi dan absorbansi. Koefisien korelasi yang baik yaitu 0.999 dan absorbansinya berada dalam rentang 0.2-0.8sesuai Hukum Lambert Beer.
Dari persamaan yang diperoleh dapat dihitung konsentrasi dari sampel dengan menggunakan persamaan:
Konsentrasi yang diperoleh yaitu 551,364 ppm. Hasil tersebut dikalikan dengan factor pengenceran (x25) sehingga diperoleh konsentrasi rhodamin dalam sampel yaitu 13784.1 ppm atau 13.7841 mg/mL. Setelah diperoleh massa rhodamain B maka dapat dihitung persentase kadarnya berdasarkan rumus:
Dengan demikian diperoleh kadar rhodamin dalam sampel lipstick 2 gram yaitu 34.46%.
Kadar rhodamin b yang diperoleh berdasarkan perhitungan tersebut cukup besar untuk suatu sediaan kosmetik karena seharusnya rhodamin b tidak digunakan sebagai pewarna lipstick apalagi dengan kadar yang tinggi. Hal itu dapat menyebabkan gangguan kesehatan. Dengan demikian dapat diketahui bahwa sampel lipstick tidak baik digunakan karena mengandung rhodamin b dengan kadar yang cukup tinggi.
Namun, pengukuran kadar ini belum tentu akurat karena persamaan garis pun tidak menunjukkan lineritas yang baik. Artinya kemungkinan konsentrasi yang dihitung tidak sebanding dengan absorbansi hasil pengukuran. Hal ini dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti proses pengenceran yang kurang kuantitatif atau adanya kontaminan seperti basis lipstick kemungkinan masih ada karena preparasi sampel yang kurang baik.


VIII. KESIMPULAN
1.      Hasil Kromatografi lapis tipis menyatakan bahwa sampel lipstik mengandung rhodamin  B dengan rf = 0.75
2.      Hasil pengukuran kadar menyatakan bahwa kadar rhodamin B yang terkandung pada lipstik adalah sebesar 34.46 %.



DAFTAR PUSTAKA

Agustina, Tina. 2009. Available Online at http://www.scribd.com/doc/23648388/15/II-3-4Kromatografi-Lapis-Tipis-Preparatif [Diakses tanggal 15-05-13].

Gritter J.R, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung. Penerbit ITB

Hamdani. 2013. Available online at http://catatankimia.com/catatan/rhodamin-b.html [Diakses tanggal 15-05-13].

Roth, H.J., Blaaschke, G. 1988. Analisis Farmasi. Penerjemah Sarjono Kisman. Yogyakarta. Universitas Gadjah Mada Press

Sastrohamidjojo. 1985. Kromatografi. Yogyakarta. Penerbit Liberty 

Wiryawan, Adam . 2011. Available Online at  http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/spektrofotometri-serapan-atom/metode-adisi-standar/  [Diakses tanggal 15-05-13].